Acqua in emulsioni olio: un nuovo sistema di montaggio idrosolubili proteine clorofilla vincolante con pigmenti idrofobi
Summary
Questo manoscritto descrive un metodo semplice e ad alta produttività per assemblare proteine solubili in acqua con pigmenti idrofobiche che è basato su emulsioni acqua-in-olio. Dimostriamo l'efficacia del metodo per l'assemblaggio di clorofille nativi con quattro varianti di ricombinante solubile in acqua-clorofilla proteine leganti (WSCPs) di piante Brassica espressi in E. coli.
Abstract
Clorofille (Chls) e batterioclorofilla (BChls) sono i cofattori principali che effettuano la raccolta luce fotosintetica e di trasporto degli elettroni. La loro funzionalità dipende in modo critico dalla loro specifica organizzazione all'interno di grandi ed elaborati complessi proteici multisubunit transmembrana. Per comprendere a livello molecolare come questi complessi facilitano conversione dell'energia solare, è essenziale comprendere proteina-pigmento, e le interazioni pigmenti pigmento, e il loro effetto sulla dinamica eccitati. Un modo per ottenere questo senso sia costruendo e studiando complessi di Chls con semplici proteine ricombinanti solubili in acqua. Tuttavia, incorporando le Chls lipofile e BChls in proteine solubili in acqua è difficile. Inoltre, non esiste un metodo generale, che potrebbero essere utilizzati per l'assemblaggio delle proteine solubili in acqua con pigmenti idrofobi. Qui, dimostriamo un sistema di throughput semplice ed alta basato su emulsioni acqua-in-olio, che consente assembly di proteine solubili in acqua con Chls idrofobi. Il nuovo metodo è stato convalidato assemblando versioni ricombinanti della clorofilla proteina legante idrosolubile di Brassicaceae piante (WSCP) con Chl a. Dimostriamo l'assemblaggio di successo di Chl A utilizzando lisati grezzi di WSCP esprimono E. cellule coli, che può essere usato per sviluppare un sistema di screening genetico per nuove proteine Chl-leganti idrosolubili, e per studi di interazione Chl-proteina e processi di assemblaggio.
Introduction
pigmenti idrofobi, come clorofille (Chls), batterioclorofilla (BChls) e carotenoidi sono i cofattori primari in centri di reazione fotosintetici e le proteine di raccolta di luce che effettuano trasporto di elettroni, e la cattura l'energia della luce e il trasferimento. I centri di reazione e la maggior parte dei complessi di raccolta della luce Chl-leganti sono proteine transmembrana. La Fenna-Matthews-Olson (FMO) proteine di batteri fotosintetici verde-zolfo non oxygenic 1,2, e la proteina peridinina-Chl (PCP) dei dinoflagellati 3 sono esempi eccezionali di solubili in acqua proteine luce raccolta. Il legame clorofilla proteine solubili in acqua (WSCPs) di Brassicacee, Polygonaceae, Chenopodiaceae e piante Amaranthaceae 4, 5 sono un altro esempio unico, ma a differenza di FMO e PCP, questi non sono coinvolti nella raccolta della luce, né in alcuna della reazione fotosintetica primaria , e la loro precisa pHYfunzioni siological sono ancora poco chiari 5-8. La loro alta affinità Chl vincolante hanno portato ad una funzione suggerito come portatori transitori di Chls e derivati Chl 9,10. In alternativa, è stato ipotizzato che WSCP svolge un ruolo nei collettori Chls in cellule danneggiate e protegge contro Chl-indotta danni photooxidative 7,11-13. Più di recente, è stato suggerito che le funzioni WSCP come un inibitore della proteasi e svolge un ruolo durante la resistenza erbivoro e regola la morte delle cellule durante lo sviluppo del fiore 14. WSCPs sono divisi in due classi principali in base alle loro proprietà fotofisiche. La prima classe (classe I, ad es. Da Chenopodium album) può subire fotoconversione su di illuminazione. WSCPs Classe II da piante del genere Brassica, che non subiscono fotoconversione 5,10, sono ulteriormente suddivisi in classe IIa (ad es., Dalla Brassica oleracea, Raphanus sativus) e IIb (ad es., Da lepidium virginicum </em>). La struttura di classe IIb WSCP da lepidium virginicum è stato risolto con la cristallografia a raggi X con una risoluzione di 2.0 Å 8. Si rivela un omotetramero simmetrica in cui le subunità proteiche formano un core idrofobico. Ogni subunità lega un singolo Chl che si traduce in una stretta disposizione di quattro Chls stipati all'interno delle core.This semplice tutti convenire Chl rende WSCPs un sistema modello potenzialmente utile per studiare vincolante e assemblaggio di complessi Chl-proteina, e gli effetti della vicina Chls e ambienti proteine sulle proprietà spettrali ed elettroniche di singoli Chls. Inoltre, può fornire modelli per la costruzione di proteine artificiali Chl vincolanti che possono essere utilizzati per i moduli che raccolgono la luce nei dispositivi fotosintetici artificiali.
Studi rigorosi di WSCPs nativi non sono realizzabili perché i complessi purificati da piante contengono sempre una miscela eterogenea di tetrameri con diverse combinazioni di Chl ae Chl b 9. Pertanto, è necessario un metodo per assemblare WSCPs ricombinanti espresse con Chls in vitro. Questo è contestata dalla trascurabile idrosolubilità Chls che rende impossibile assemblare il complesso in vitro per semplice miscelazione dei apoproteine idrosolubili con pigmenti in soluzioni acquose. In vitro assemblaggio miscelando i apoproteine con membrane tilacoidi 15 è stata dimostrata, ma questo metodo è limitato al nativo Chls presente nei tilacoidi. Schmidt et al. riportato sul montaggio diversi derivati Chl e BCHL con WSCP dal cavolfiore (CaWSCP) esprimendo una proteina ricombinante, istidina-marcato in E. coli immobilizzare esso su una colonna Ni-affinità e l'introduzione di strumenti derivati Chl solubilizzati nei detergenti 11. Con successo della ricostituzione di WSCPs ricombinanti da A. thaliana 6, e cavolini di Bruxelles (BoWSCP), giapponese ravanello selvatico (RshWSCP) unsono stati anche riferito d Virginia pepperweed (LvWSCP) con un metodo simile.
Qui, vi presentiamo un romanzo, in generale, il metodo semplice per l'assemblaggio di Chls con WSCP che non richiede codifica o immobilizzare le proteine. Essa si basa sulla preparazione di emulsioni dalle loro soluzioni acquose dei apoproteine idrosolubili in olio minerale. Le proteine sono quindi incapsulati in acqua-in-olio (W / O) microgocce con un'elevata superficie in rapporto al volume 16. I cofattori idrofobi vengono disciolti nell'olio e vengono facilmente introdotti nelle goccioline della fase oleosa. Riportiamo di utilizzare il metodo per l'assemblaggio di diverse varianti di apoproteine WSCP ricombinante espresse in E. coli con Chl a. Dimostriamo il gruppo dal lisato grezzo di batteri WSCP-iperespressione che possono essere utilizzati come un sistema di screening per lo sviluppo di nuovi Chl proteine leganti.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il nostro obiettivo era quello di sviluppare un nuovo sistema generale per l'assemblaggio delle proteine clorofilla-binding solubili in acqua con pigmenti idrofobiche. Qui si dimostra che il nuovo sistema di ricostituzione basato su W / O emulsione è un approccio generale dimostrato di funzionare per l'assemblaggio di apoproteine WSCP da cavolini di Bruxelles, cavolfiore, rafano giapponese e Virginia pepperweed ricombinante espresse in E. coli. Qui i risultati sono presentati dalla ricostit…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
DN riconosce il sostegno dell'Unione europea del 7 ° PQ progetti PEPDIODE (GA 256.672) e REGPOT-2012-2013-1 (GA 316.157), e un assegno di ricerca personale (n ° 268/10) dalla Israel Science Foundation. Ringraziamo il Prof. Shmuel Rubinstein, Facoltà di Ingegneria e Scienze Applicate, Università di Harvard, Cambridge, MA, USA per prendere le immagini di microscopia confocale.
Materials
| Mineral oil | Sigma | M5904 | |
| Span80 | Sigma | 85548 | |
| Tween80 | Sigma | P8074 | |
| Bio-Scale Mini Profinity eXact Cartridges | Bio Rad | 10011164 | Affinity chromatography for WSCP purification with native sequence. |
| His Trap HF column | GE Healthcare Life Science | 17-5248-02 | Affinity chromatography for WSCP purification with His-tag |
| DEAE Sepharose Fast Flow | GE Healthcare Life Science | 17-0709-01 | Chromatography medium for chlorophyll purification |
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