Water in olie emulsies: Een nieuw systeem voor het samenstellen van water-oplosbare-Chlorophyll bindende eiwitten met Pigmenten Hydrofobe
Summary
Dit manuscript beschrijft een eenvoudige en high-throughput werkwijze voor het samenstellen in water oplosbare eiwitten met hydrofobe pigmenten die is gebaseerd op water-in-olie-emulsies. We tonen de effectiviteit van de werkwijze voor de assemblage van natieve chlorofyl vier varianten van recombinant water oplosbare chlorofyl-bindende eiwitten (WSCPs) van Brassica planten tot expressie gebracht in E. coli.
Abstract
Chlorofyl (Chls) en bacteriochlorofylen (BChls) zijn de primaire co-factoren die fotosynthetische licht oogsten en elektron transport uit te voeren. Hun functionaliteit kritisch afhankelijk van hun specifieke organisatie in grote en ingewikkelde multisubunit transmembraaneiwit complexen. Om te begrijpen op moleculair niveau hoe deze complexen vergemakkelijken zonne-energie conversie, is het essentieel om eiwit-pigment en pigment pigment-interacties en hun effect op opgewonden dynamiek begrijpen. Een manier van het verkrijgen van een dergelijk begrip is door de aanleg en het bestuderen van complexen van Chls met eenvoudige water oplosbare recombinante eiwitten. Echter, waarin de lipofiele Chls en BChls in water oplosbare eiwitten is moeilijk. Bovendien is er geen algemene methode, die kan worden gebruikt voor montage van in water oplosbare eiwitten met hydrofobe pigmenten. Hier tonen we een eenvoudige en high throughput systeem op basis van water-in-olie emulsies, die mogelijk maakt assembly van in water oplosbare eiwitten met hydrofobe Chls. De nieuwe werkwijze werd gevalideerd door het samenvoegen van recombinant versies van de in water oplosbare chlorofyl bindingeiwit Brassicaceae planten (WSCP) met een Chl. We tonen de succesvolle montage van Chl een met behulp van ruwe lysaten van WSCP uitdrukken E. coli cellen, die kunnen worden gebruikt voor het ontwikkelen van een genetische screen voor nieuwe wateroplosbare Chl-bindende eiwitten en voor studies van Chl-eiwit interacties en assemblageprocessen.
Introduction
Hydrofobe pigmenten zoals chlorofyl (Chls), bacteriochlorofylen (BChls) en carotenoïden zijn de primaire co-factoren in fotosynthetische reactie centra en lichte harvesting eiwitten die elektronentransport, en licht energie op te vangen en de overdracht uit te voeren. Het reactiemengsel centra en de meeste van de Chl-bindende light harvesting complexen transmembraan eiwitten. De Fenna-Matthews-Olson (FMO) eiwit van niet-oxygenic fotosynthetische groene zwavel bacteriën 1,2, en de peridinin-Chl eiwit (PCP) van dinoflagellaten 3 zijn uitzonderlijke voorbeelden van water oplosbare licht harvesting eiwitten. De in water oplosbare chlorofyl bindende eiwitten (WSCPs) van Brassicaceae, Polygonaceae, Chenopodiaceae en Amaranthaceae installaties 4, 5 zijn een uniek voorbeeld, maar in tegenstelling tot FMO en PCP, deze zijn niet betrokken in light harvesting of in een van de primaire fotosynthetische reactie , en hun precieze physiological functies zijn nog onduidelijk 5-8. Hun hoge Chl-bindingsaffiniteit hebben geleid tot een voorgestelde functie als tijdelijke dragers van Chls Chl en derivaten 9,10. Als alternatief werd de hypothese dat WSCP speelt een rol in het wegvangen Chls in beschadigde cellen en beschermt tegen Chl-geïnduceerde oxidatieve schade 7,11-13. Recenter werd gesuggereerd dat WSCP functioneert als een proteaseremmer en speelt een rol bij herbivore weerstand en reguleert celdood bij bloemontwikkeling 14. WSCPs worden onderverdeeld in twee hoofdklassen volgens hun fotofysische eigenschappen. De eerste klasse (klasse I, bijv. Uit Chenopodium album) kan photoconversion ondergaan bij belichting. II WSCPs van Brassica planten, die niet photoconversion 5,10 ondergaan, worden verder onderverdeeld in klasse IIa (bijv., Uit Brassica oleracea, Raphanus sativus) en IIb (bijv., Van Lepidium virginicum </em>). De structuur van de klasse IIb WSCP van Lepidium virginicum werd opgelost door röntgenkristallografie bij 2,0 Å resolutie 8. Het openbaart een symmetrische homotetrameer waarin het eiwit subeenheden vormen een hydrofobe kern. Elke subeenheid bindt één Chl die resulteert in een strakke regeling van vier dicht opeengepakte Chls binnen core.This eenvoudige all Chl opstelling maakt WSCPs een nuttig model voor het bestuderen binding en assemblage van Chl-eiwitcomplexen, en de effecten van aangrenzende Chls en eiwit omgevingen op de spectrale en elektronische eigenschappen van individuele Chls. Bovendien kan het sjablonen voor het construeren van kunstmatige Chl-bindende eiwitten die kunnen worden gebruikt voor lichte oogsten modules in kunstmatige fotosynthetische nicatieapparatuur.
Rigoureuze studies van natief WSCPs niet haalbaar omdat de complexen gezuiverd uit planten een heterogeen mengsel van tetrameren met verschillende combinaties van een Chl bevatten altijden Chl b 9. Aldus wordt een werkwijze voor het assembleren van recombinant tot expressie WSCPs met Chls in vitro vereist. Dit wordt uitgedaagd door de verwaarloosbare wateroplosbaarheid van Chls waardoor het onmogelijk om het complex in vitro assembleren door eenvoudig mengen van het wateroplosbare apoproteins met pigmenten in waterige oplossingen. In vitro assemblage door mengen van de apoproteïnen met thylakoïdmembranen 15 werd aangetoond, maar deze methode wordt beperkt tot de natieve Chls in de thylakoiden. Schmidt et al. rapporteerde over het monteren van een aantal Chl en BChl derivaten met WSCP van bloemkool (CaWSCP) door recombinant expressie brengen van een histidine-tag eiwit in E. coli immobiliseren deze op een Ni-affiniteitskolom en invoering Chl derivaten opgelost in 11 detergentia. Succesvol reconstitutie van recombinant WSCPs van A. thaliana 6, en spruitjes (BoWSCP), Japans wilde radijs (RshWSCP) eend Virginia pepperweed (LvWSCP) op een dergelijke manier werden ook gemeld.
Hier presenteren we een nieuwe, algemene, eenvoudige werkwijze voor het assembleren Chls met WSCP die geen tagging vereist of immobiliseren van de eiwitten. Het berust op het bereiden van emulsies van de waterige oplossingen van de wateroplosbare apoproteïnen in minerale olie. De eiwitten worden aldus ingekapseld in water-in-olie (W / O) microdruppeltjes met zeer hoog oppervlak volumeverhouding 16. De hydrofobe cofactoren worden vervolgens opgelost in de olie en worden gemakkelijk geïntroduceerd in de druppeltjes van de oliefase. We rapporteren volgens de werkwijze voor het samenstellen van verschillende varianten van WSCP apoproteïnen recombinant tot expressie gebracht in E. coli met Chl a. We tonen het samenstel uit ruw lysaat van WSCP overexpressie bacteriën die kunnen worden gebruikt als een screening voor de ontwikkeling van nieuwe Chl eiwitten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ons doel was om een nieuw algemeen stelsel samenstel van in water oplosbare chlorofyl-bindende eiwitten met hydrofobe pigmenten ontwikkelen. Hier wordt aangetoond dat de nieuwe reconstructie op basis van W / O-emulsie is een algemene benadering bewezen te werken voor de montage WSCP apoproteïnen van spruitjes, bloemkool, Japanse mierikswortel en Virginia pepperweed recombinant tot expressie gebracht in E. coli. Hier resultaten gepresenteerd van reconstitutie van 1 mg WSCP met 10-voudige molaire overmaat …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
DN erkent de steun van EU FP7-projecten PEPDIODE (GA 256.672) en REGPOT-2012-2013-1 (GA 316.157), en een persoonlijke onderzoeksbeurs (nr 268/10) van het Israël Science Foundation. Wij danken Prof. Shmuel Rubinstein, School of Engineering and Applied Sciences, Universiteit van Harvard, Cambridge MA, Verenigde Staten voor het nemen van de confocale microscopie beelden.
Materials
| Mineral oil | Sigma | M5904 | |
| Span80 | Sigma | 85548 | |
| Tween80 | Sigma | P8074 | |
| Bio-Scale Mini Profinity eXact Cartridges | Bio Rad | 10011164 | Affinity chromatography for WSCP purification with native sequence. |
| His Trap HF column | GE Healthcare Life Science | 17-5248-02 | Affinity chromatography for WSCP purification with His-tag |
| DEAE Sepharose Fast Flow | GE Healthcare Life Science | 17-0709-01 | Chromatography medium for chlorophyll purification |
Riferimenti
- Bryant, D. A., Frigaard, N. -. U. Prokaryotic photosynthesis and phototrophy illuminated. Trends Microbiol. 14, 488-496 (2006).
- Tronrud, D. E., Wen, J. Z., Gay, L., Blankenship, R. E. The structural basis for the difference in absorbance spectra for the FMO antenna protein from various green sulfur bacteria. Photosynth. Res. 100, 79-87 (2009).
- Schulte, T., Johanning, S., Hofmann, E. Structure and function of native and refolded peridinin-chlorophyll-proteins from dinoflagellates. Eur. J. Cell Biol. 89, 990-997 (2010).
- Renger, G., et al. Water soluble chlorophyll binding protein of higher plants: a most suitable model system for basic analyses of pigment-pigment and pigment-protein interactions in chlorophyll protein complexes. J. Plant Physiol. 168, 1462-1472 (2011).
- Satoh, H., Uchida, A., Nakayama, K., Okada, M. Water-soluble chlorophyll protein in Brassicaceae plants is a stress-induced chlorophyll-binding protein. Plant Cell Physiol. 42, 906-911 (2001).
- Bektas, I., Fellenberg, C., Paulsen, H. Water-soluble chlorophyll protein (WSCP) of Arabidopsis is expressed in the gynoecium and developing silique. Planta. 236, 251-259 (2012).
- Damaraju, S., Schlede, S., Eckhardt, U., Lokstein, H., Grimm, B. Functions of the water soluble chlorophyll-binding protein in plants. J. Plant Physiol. 168, 1444-1451 (2011).
- Horigome, D., et al. Structural mechanism and photoprotective function of water-soluble chlorophyll-binding protein. J. Biol. Chem. 282, 6525-6531 (2007).
- Reinbothe, C., Satoh, H., Alcaraz, J. -. P., Reinbothe, S. A Novel Role of Water-Soluble Chlorophyll Proteins in the Transitory Storage of Chorophyllide. Plant Physiol. 134, 1355-1365 (2004).
- Satoh, H., Nakayama, K., Okada, M. Molecular cloning and functional expression of a water-soluble chlorophyll protein, a putative carrier of chlorophyll molecules in cauliflower. J. Biol. Chem. 273, 30568-30575 (1998).
- Schmidt, K., Fufezan, C., Krieger-Liszkay, A., Satoh, H., Paulsen, H. Recombinant water-soluble chlorophyll protein from Brassica oleracea var. Botrys binds various chlorophyll derivatives. Biochimica. 42, 7427-7433 (2003).
- Takahashi, S., et al. Molecular cloning, characterization and analysis of the intracellular localization of a water-soluble Chl-binding protein from Brussels sprouts (Brassica oleracea var. gemmifera). Plant Cell Physiol. 53, 879-891 (2012).
- Takahashi, S., Ono, M., Uchida, A., Nakayama, K., Satoh, H. Molecular cloning and functional expression of a water-soluble chlorophyll-binding protein from Japanese wild radish. J. Plant Physiol. 170, 406-412 (2013).
- Boex-Fontvieille, E., Rustgi, S., von Wettstein, D., Reinbothe, S., Reinbothe, C. Water-soluble chlorophyll protein is involved in herbivore resistance activation during greening of Arabidopsis thaliana. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, 7303-7308 (2015).
- Hughes, J. L., et al. Magneto-optic spectroscopy of a protein tetramer binding two exciton-coupled chlorophylls. J. Am. Chem. Soc. 128, 3649-3658 (2006).
- Bednarczyk, D., Takahashi, S., Satoh, H., Noy, D. Assembly of water-soluble chlorophyll-binding proteins with native hydrophobic chlorophylls in water-in-oil emulsions. BBA – Bioenergetics. 1847, 307-313 (2015).
- Fiedor, L., Rosenbach-Belkin, V., Scherz, A. The stereospecific interaction between chlorophylls and chlorophyllase. Possible implication for chlorophyll biosynthesis and degradation. J. Biol. Chem. 267, 22043-22047 (1992).
- Kamimura, Y., Mori, T., Yamasaki, T., Katoh, S. Isolation, properties and a possible function of a water-soluble chlorophyll a/b-protein from brussels sprouts. Plant Cell Physiol. 38, 133-138 (1997).
- Murata, T., Itoh, R., Yakushiji, E. Crystallization of water-soluble chlorophyll-proteins from Lepidium virginicum. Biochim. Biophys. Acta. 593, 167-170 (1980).
