Fysisk Isolering av Endospores från miljöprover genom riktade Lys av vegetativa celler
Summary
A method to single out bacterial endospores from complex microbial communities was developed to perform tailored culture or molecular studies of this group of bacteria.
Abstract
Endospore formation is a survival strategy found among some bacteria from the phylum Firmicutes. During endospore formation, these bacteria enter a morpho-physiological resting state that enhances survival under adverse environmental conditions. Even though endospore-forming Firmicutes are one of the most frequently enriched and isolated bacterial groups in culturing studies, they are often absent from diversity studies based on molecular methods. The resistance of the spore core is considered one of the factors limiting the recovery of DNA from endospores. We developed a method that takes advantage of the higher resistance of endospores to separate them from other cells in a complex microbial community using physical, enzymatic and chemical lysis methods. The endospore-only preparation thus obtained can be used for re-culturing or to perform downstream analysis such as tailored DNA extraction optimized for endospores and subsequent DNA sequencing. This method, applied to sediment samples, has allowed the enrichment of endospores and after sequencing, has revealed a large diversity of endospore-formers in freshwater lake sediments. We expect that the application of this method to other samples will yield a similar outcome.
Introduction
Målet med detta arbete är att ge ett protokoll för separation av bakterie endosporer från vegetativa bakterieceller i miljöprover. Bildningen av bakteriella endosporer är en överlevnadsstrategi, oftast utlöses av svält, finns i ett antal av bakteriegrupper som tillhör stammen Firmicutes 1. Endospor bildande bakterier är väl studerade, främst eftersom ett antal stammar är patogener och därmed av medicinsk betydelse (t.ex. Bacillus anthracis eller Clostridium difficile). Miljö stammar av endospor bildande bakterier har isolerats från praktiskt taget alla miljöer (jord, vatten, sediment, luft, is, människans tarm, djur gut, och mera) 1-3. Därför Firmicutes är den näst mest förekommande provins i kultursamlingar 4.
På grund av deras härdade yttre cortex och skyddande kärnproteiner, kan endosporer överleva extrema miljöförhållanden som sträcker sig frOm uttorkning till hög strålning, extrema temperaturer och skadliga kemikalier 5. Denna märkliga motstånd gör det till en utmaning att utvinna DNA från endosporer 6-8. Detta förklarar sannolikt varför de har förbisetts i miljösekvense studier 9,10. Andra metoder, såsom målsökning av endosporer i miljöprover genom fluorescerande antikroppar 11, kvantifiering av dipikolinsyra (DPA) i jord 12 och sediment 13, flödescytometri 14 eller pastörisering och efterföljande odling 15,16 har använts för att hämta eller kvantifiera endosporer i miljöprover. Under de senaste åren, till optimerad DNA extraktionsmetoder samt specifika molekylära primers rikta endospor specifika gensekvenser har utvecklats 10,17-20. Detta har bidragit till att avslöja mer biologisk mångfald bland denna grupp av bakterier 21 och har också lett till tillämpningar inom industri och medicin för upptäckten av endosporer, Exempelvis i mjölkpulver 19.
Protokollet presenteras här bygger på skillnaden i motståndet mot skadliga fysikalisk-kemiska förhållanden (såsom värme och rengöringsmedel) av bakteriella endosporer förhållande till vegetativa celler. Att förstöra vegetativa celler i ett prov, vi följd applicera värme, lysozym och låga koncentrationer av rengöringsmedel. Tiden och styrkan av dessa behandlingar har optimerats för att inte förstöra sporer, men att lysera alla vegetativa celler. Vissa celler i ett miljö cellpol är mer resistenta än andra, så för att öka sannolikheten för att förstöra alla vegetativa celler, tillämpar vi tre olika behandlingar. Fördelen och nyhet med denna metod är att endosporer efter behandlingen är fortfarande intakt och kan användas för ytterligare analyser nedströms. Dessa inkluderar DNA-extraktion, kvantitativ PCR (qPCR) och amplicon eller metagenomic sekvensering (inriktning särskilt gruppen av endosporer och därmed minska diversity, samtidigt som man ökar täckningen). De endosporer skulle också kunna användas för nedströms odling eller kvantifiering genom fluorescensmikroskopi, flödescytometri, eller detektering av DPA. En viktig egenskap hos detta förfarande är att genom att jämföra ett obehandlat prov med en behandlat prov, kan ett härleda mängden och mångfalden av endosporer i ett miljöprov förutom den komponent som motsvarar vegetativa celler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Motståndet av endosporer till externa aggressiva fysikalisk-kemiska faktorer (t.ex. temperatur eller rengöringsmedel) användes för att ta fram en metod för att skilja bakteriella endosporer från vegetativa celler i miljöprover. Detta är den första heltäckande metod för att isolera endosporer från miljöprover på ett icke-förstörande sätt. Tidigare metoder för att kvantifiera, upptäcka eller analysera endosporer i prover baserades på mätning av specifika ombud för endosporer såsom dipikolin…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna erkänner Swiss National Science Foundation för Grant No. 31003A-132358/1, 31003A_152972 och nr 151948, och Fundation Pierre Mercier pour la Science.
Materials
| Whatman nitrocellulose membrane filters, 0,2 um pore size, 47 mm diameter | Sigma-Aldrich | WHA7182004 Aldrich | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Aldrich | 252859 Sigma-Aldrich | CAS 77-86-1 |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 Sigma-Aldrich | CAS 60-00-4 |
| Lysozyme from chicken egg white | Sigma-Aldrich | 62971 Fluka | powder, CAS 12650-88-3 |
| Ultra-Turrax homogenizer T18 basic | IKA | 3720000 | |
| Glass filter holders for 47 mm membranes, pyrex glass | EMD Millipore | XX10 047 00 | |
| Chemical duty vacuum pump | Millipore | WP6122050 | 220 V/50 Hz |
| Manifold sampling filtration for 25 mm membranes | Millipore | 1225 Sampling Manifold | polypropylene |
| Dnase | New England Biolabs | M0303S | Rnase free |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881 Sigma-Aldrich | CAS 1310-73-2 |
| Sodium dodecyl sulfphate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 Sigma | |
| Whatman nitrocellulose membrane filters, 0,2 um pore size, 25 mm diameter | Sigma-Aldrich | WHA7182002 Aldrich | |
References
- Nicholson, W. L. Roles of Bacillus endospores in the environment. Cell Mol Life Sci. 59 (3), 410-416 (2002).
- Lester, E. D., Satomi, M., Ponce, A. Microflora of extreme arid Atacama Desert soils. Soil Biol Biochem. 39 (2), 704-708 (2007).
- Wilson, M. S., Siering, P. L., White, C. L., Hauser, M. E., Bartles, A. N. Novel archaea and bacteria dominate stable microbial communities in North America’s Largest Hot Spring. Microb Ecol. 56 (2), 292-305 (2008).
- Hugenholtz, P. Exploring prokaryotic diversity in the genomic era. Genome Biol. 3 (2), (2002).
- Onyenwoke, R. U., Brill, J. A., Farahi, K., Wiegel, J. Sporulation genes in members of the low G+C Gram-type-positive phylogenetic branch (Firmicutes). Arch Microbiol. 182 (2-3), 182-192 (2004).
- Delmont, T. O., et al. Accessing the soil metagenome for studies of microbial diversity. Appl Environ Microbiol. 77 (4), 1315-1324 (2011).
- Ricca, E., Henriques, A. O., Cutting, S. M. . Bacterial spore formers: probiotics and emerging applications. , (2004).
- Kuske, C. R., et al. Small-Scale DNA Sample Preparation Method for Field PCR Detection of Microbial Cells and Spores in Soil. Appl Environ Microbiol. 64 (7), 2463-2472 (1998).
- von Mering, C., et al. Quantitative phylogenetic assessment of microbial communities in diverse environments. Science. 315 (8515), 1126-1130 (2007).
- Wunderlin, T., Junier, T., Roussel-Delif, L., Jeanneret, N., Junier, P. Stage 0 sporulation gene A as a molecular marker to study diversity of endospore-forming Firmicutes. Environ Microbiol Rep. 5 (6), 911-924 (2013).
- Siala, A., Hill, I. R., Gray, T. R. G. Populations of spore-forming bacteria in an acid forest soil, with special reference to Bacillus subtilis. J General Microbiol. 81 (1), 183-190 (1974).
- Brandes Ammann, A., Kolle, L., Brandl, H. Detection of bacterial endospores in soil by terbium fluorescence. Int J Microbiol. , 435281 (2011).
- Fichtel, J., Koster, J., Rullkotter, J., Saas, H. High variations in endospore numbers within tidal flat sediments revealed by quantification of dipicolinic acid. Geomicrobiol J. 25 (7-8), (2008).
- Cronin, U. P., Wilkinson, M. G. The potential of flow cytometry in the study of Bacillus cereus. J Appl Microbiol. 108 (1), 1-16 (2010).
- de Rezende, J. R., et al. Dispersal of thermophilic Desulfotomaculum endospores into Baltic Sea sediments over thousands of years. ISME J. 7 (1), 72-84 (2013).
- Hubert, C., et al. Thermophilic anaerobes in Arctic marine sediments induced to mineralize complex organic matter at high temperature. Environ Microbiol. 12 (4), 1089-1104 (2010).
- Garbeva, P., van Veen, J. A., van Elsas, J. D. Predominant Bacillus spp. in agricultural soil under different management regimes detected via PCR-DGGE. Microb Ecol. 45 (3), 302-316 (2003).
- Brill, J. A., Wiegel, J. Differentiation between spore-forming and asporogenic bacteria using a PCR and southern hybridization based method. J Microbiol Methods. 31 (1-2), 29-36 (1997).
- Rueckert, A., Ronimus, R. S., Morgan, H. W. Development of a real-time PCR assay targeting the sporulation gene, spo0A., for the enumeration of thermophilic bacilli in milk powder. Food Microbiol. 23 (3), 220-230 (2006).
- Bueche, M., et al. Quantification of endospore-forming firmicutes by quantitative PCR with the functional gene spo0A. Appl Environ Microbiol. 79 (17), 5302-5312 (2013).
- Wunderlin, T., Junier, T., Roussel-Delif, L., Jeanneret, N., Junier, P. Endospore-enriched sequencing approach reveals unprecedented diversity of Firmicutes in sediments. Environ Microbiol Rep. 6 (6), 631-639 (2014).
- Nicholson, W. L., Law, J. F. Method for purification of bacterial endospores from soils: UV resistance of natural Sonoran desert soil populations of Bacillus spp. with reference to B. subtilis strain 168. J Microbiol Methods. 35 (1), 13-21 (1999).
