पूर्व Vivo चिकी अनुमस्तिष्क स्लाइस की संस्कृति और स्पैटियली Electroporation ग्रेन्युल सेल व्यापारियों की लक्षित
Summary
अनुमस्तिष्क बाहरी दाना परत विकासशील मस्तिष्क में सबसे बड़ा पारगमन प्रवर्धन की साइट है। यहाँ, हम भ्रूण दिन 14 लड़की भ्रूण से पूर्व vivo electroporation और अनुमस्तिष्क स्लाइस की संस्कृति का उपयोग प्रसार के शिखर पर इस परत के लिए आनुवंशिक परिवर्तन लक्षित करने के लिए एक प्रोटोकॉल उपस्थित थे।
Abstract
अनुमस्तिष्क बाहरी दाना परत (EGL) विकासशील मस्तिष्क में सबसे बड़ा पारगमन प्रवर्धन की साइट है, और neuronal प्रसार और भेदभाव के अध्ययन के लिए एक शानदार मॉडल है। इसके अलावा, अपने proliferative क्षमता के विकासवादी संशोधनों सेरिबैलम कशेरुकी मस्तिष्क के एवो-देवो के अध्ययन के लिए एक शानदार मॉडल बनाने, उल्वों में अनुमस्तिष्क आकार के नाटकीय विस्तार के लिए जिम्मेदार है। EGL के घटक कोशिकाओं, अनुमस्तिष्क ग्रेन्युल पूर्वज भी, medulloblastoma के लिए सबसे अधिक प्रचलित बाल चिकित्सा न्यूरोनल ट्यूमर मूल के एक महत्वपूर्ण सेल प्रतिनिधित्व करते हैं। पारगमन प्रवर्धन के बाद, दाना व्यापारियों वे परिपक्व स्तनधारी दिमाग में सबसे बड़ा न्यूरोनल आबादी का प्रतिनिधित्व करते हैं जहां सेरिबैलम के आंतरिक बारीक परत में त्रिज्यात पलायन। लड़की में, EGL प्रसार के शिखर हमल के दूसरे सप्ताह के अंत में होता है। पर इस परत के लिए आनुवंशिक परिवर्तन लक्षित करने के लिएप्रसार के शिखर, हम भ्रूण दिन 14 लड़की भ्रूण से सेरिबैलम स्लाइस के पूर्व vivo electroporation के माध्यम से आनुवंशिक हेरफेर के लिए एक तरीका विकसित किया है। इस विधि में विवो दाना न्यूरॉन विकास के कई महत्वपूर्ण पहलुओं का स्मरण दिलाता है और अनुमस्तिष्क ग्रेन्युल सेल प्रसार और भेदभाव की एक पूरी तरह से समझ पैदा करने में उपयोगी हो जाएगा, और इस तरह सेरिबैलम विकास, विकास और रोग की।
Introduction
सेरिबैलम hindbrain के पूर्वकाल अंत में बैठता है और परिपक्व मस्तिष्क में संवेदी और मोटर प्रसंस्करण के एकीकरण के लिए जिम्मेदार है और साथ ही उच्च संज्ञानात्मक प्रक्रियाओं 1 को विनियमित है। स्तनपायी और पक्षियों में, यह वयस्क दिमाग में न्यूरॉन्स की आधी से अधिक उत्पादन करता है कि विकास के दौरान, progenitors के व्यापक पारगमन प्रवर्धन का एक उत्पाद एक विस्तृत आकृति विज्ञान के पास है और भारी foliated है। सेरिबैलम सदियों से neurobiologists के लिए और आणविक युग में अध्ययन के एक विषय रहा है वैसे ही महत्वपूर्ण ध्यान दिया गया है। यह अपने स्वाभाविक दिलचस्प जीव विज्ञान के लिए, लेकिन यह भी भारी ऐसे सबसे अधिक प्रचलित बाल मस्तिष्क है जो आत्मकेंद्रित स्पेक्ट्रम विकारों के 2 और सबसे प्रमुखता अनुमस्तिष्क कैंसर, medulloblastoma 3, के रूप में विकास आनुवंशिक विकारों सहित मानव रोग में फंसा है कि इस तथ्य को न केवल संबंधित है ट्यूमर। महत्वपूर्ण बात है, यह क भीतर एक उत्कृष्ट मॉडल प्रणाली हैआईसीएच मस्तिष्क के विकास को 4 के दौरान भाग्य आवंटन और न्यूरोजेनेसिस अध्ययन करने के लिए। हाल के वर्षों में, यह भी कशेरुकी फिलोजेनी 5-10 भर में देखा अनुमस्तिष्क रूपों की विशाल विविधता के कारण मस्तिष्क के विकास के तुलनात्मक अध्ययन के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में स्थापित किया गया है।
सेरिबैलम hindbrain 11 में rhombomere 1 के पृष्ठीय आधे से विकसित और विकासात्मक दो प्राथमिक पूर्वज आबादी, विषमकोण होंठ और निलय क्षेत्र के शामिल है। विषमकोण होंठ छत की थाली के साथ सीमा पर hindbrain की neuroepithelium के पृष्ठीय क्षेत्र के आसपास फैली हुई है। यह सेरिबैलम 12-14 के ग्लूटामेटरगिक उत्तेजक न्यूरॉन्स का जन्मस्थान है। निलय क्षेत्र सबसे प्रमुखता से निरोधात्मक GABAergic अनुमस्तिष्क न्यूरॉन्स, बड़े पुर्किन्जे न्यूरॉन्स 14,15 को जन्म देता है। बाद विकास में (माउस में भ्रूण दिन 13.5 के बारे में से; लड़की 16 में E6), ग्लूटामेटरगिक PROGENitors rhombic होंठ से tangentially विस्थापित और progenitors के एक pial परत के रूप में: एक माध्यमिक पूर्वज क्षेत्र बाहरी दाना परत (EGL) कहा जाता है। यह परिपक्व मस्तिष्क में पाया दाना न्यूरॉन्स की भारी संख्या की ओर जाता है कि व्यापक पारगमन प्रवर्धन से होकर गुजरती है कि इस परत है।
EGL में प्रसार लंबे सेल चक्र से बाहर निकलें और बीच में बाहरी EGL परत से उनके बाहर निकलने के साथ जुड़े होने progenitors के neuronal भेदभाव करने के लिए स्विच के साथ, विषमकोण होंठ 17 से स्पर्शरेखा प्रवास से यह परिणाम है कि उप-pial स्थान से जोड़ा गया है EGL 18। औसत दर्जे का पार्श्व अक्ष में बाद mitotic दाना कोशिकाओं के व्यापक स्पर्शरेखा पलायन परिपक्व अनुमस्तिष्क कॉर्टेक्स के भीतरी दाना परत में अंतिम रेडियल माइग्रेशन से पहले, मध्य और भीतरी EGL 19 में होता है। अनुमस्तिष्क सतह पर rhombic होंठ से कोशिकाओं के प्रवास पिया 20-22 से CXCL12 सिगनल पर निर्भर है </sup> और दाना कोशिकाओं CXCL12 रिसेप्टर CXCR4 व्यक्त करते हैं। उनके स्पर्शरेखा पलायन निरोधात्मक interneuron आबादी 23-25 पलायन कर neocortical tangentially की है कि इस प्रकार याद ताजा करती है। दिलचस्प, इलेक्ट्रॉन सूक्ष्म अध्ययनों 17 एक proliferative आकृति विज्ञान के साथ EGL कोशिकाओं स्तनधारी कोर्टेक्स 26 के बेसल पूर्वज की याद ताजा एक तरीके से proliferative क्षमता के साथ सेल के व्यवहार को जोड़ने, pial संपर्क बनाए रखने कि सुझाव दिया है। यह 18 हस्ताक्षर दाना व्यापारियों विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति है, जहां अलग बाह्य वातावरण और से परिभाषित कर रहे हैं कि तीन sublayers में EGL के aforementioned स्तरीकरण में दिखाई देता है।
OEGL में पूर्वज के प्रसार के पूर्वज व्यक्तिगत रूप से आनुवंशिक रूप से माउस में भ्रूण के विकास के अंत में चिह्नित कर रहे हैं, जब वे 250-500 postmitotic जी की एक मंझला औसत को जन्म दे ऐसी है कि क्लोन आकार के एक सामान्य वितरण के साथ होता हैranule न्यूरॉन्स 27,28। परमाणु अप्रसार पुर्किन्जे न्यूरॉन्स 29-32 अंतर्निहित से mitogenic श सिगनल पर निर्भर है। श करने के लिए प्रतिक्रिया करने की क्षमता प्रतिलेखन कारक Atoh1 की सेल स्वायत्त अभिव्यक्ति पर पूरी तरह से निर्भर होना दिखाया गया है, इन विट्रो 33 और इन विवो 34,35 में दोनों। इसी तरह, सेल चक्र से बाहर निकलें और भेदभाव की संभावना Atoh1 37 का एक सीधा repressor है जो नीचे की ओर प्रतिलेखन कारक NeuroD1 36, की अभिव्यक्ति पर निर्भर होने के लिए दिखाया गया है।
सेल चक्र से बाहर निकलने के 38-42 की सेल जैविक आधार गूढ़ रहस्य में इस प्रगति, और काफी उन्नति के बावजूद, निर्णय आबाद है कि मौलिक आणविक तंत्र (एस) सेल चक्र से बाहर निकलने के लिए और एक फर्क न्यूरॉन के लिए एक पूर्वज से संक्रमण के लिए, और भीतरी EGL में जुड़े postmitotic स्पर्शरेखा प्रवास के रूप में अच्छी तरह से बाद में स्विचरेडियल प्रवास करने के लिए, समझ में आ अधूरे रहते हैं। इस वजह से EGL की प्रयोगात्मक असभ्यता की एक बड़ी हद तक है: यह देर से विकास, और एक ही तंत्रिकाजन्य अणुओं के कई महत्वपूर्ण पहले दाना व्यापारियों के जीवन में rhombic होंठ पर भी रहे हैं के बाद से आनुवंशिक रूप से लक्षित करने के लिए मुश्किल है। इस मुद्दे पर काबू पाने के लिए, कई लेखकों कृन्तकों 43-48 में प्रसव के बाद सेरिबैलम को लक्षित करने के एक तरीके के रूप विवो और पूर्व vivo electroporation में विकसित किया है। यहाँ, हम लागत और सुविधा के मामले में काफी फायदे का प्रतिनिधित्व करता है जो EGL, अध्ययन करने के लिए लड़की में पूर्व vivo electroporation के उपयोग के अग्रणी। Electroporation और लड़की अनुमस्तिष्क ऊतक के पूर्व vivo टुकड़ा संस्कृति की हमारी विधि 14 लड़कियों EGL प्रसार के चरम पर भ्रूण दिन से ऊतक विच्छेदित का उपयोग करता है। इस विधि rhombic होंठ की स्वतंत्र रूप से EGL के आनुवंशिक लक्ष्य-निर्धारण की अनुमति देता है और दाना से संक्रमण की आनुवंशिक विच्छेदन के लिए मंच तैयार करेंगेसेरिबैलम में postmitotic दाना न्यूरॉन के पूर्वज।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां बताया प्रोटोकॉल, विदारक electroporating और लड़की से भ्रूण दिन 14 सेरिबैलम के स्लाइस के संवर्धन के लिए एक विधि का वर्णन है। इस प्रोटोकॉल व्यक्ति अनुमस्तिष्क पालियों के अलग लक्ष्य-निर्धारण सहित EGL के छोटे फोकल…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस लेख में प्रस्तुत विधि बीबीएसआरसी बी बी / द्वारा वित्त पोषित काम से उठी I021507 / 1 (टीबी, RJTW) और एक एमआरसी डॉक्टरेट की छात्रवृत्ति (महाराष्ट्र)।
Materials
| McIlwain tissue chopper | Mickle Laboratory Engineering Ltd | Cut at 300μm for best results. | |
| Basal Medium Eagle (Gibco) | Life Technologies | 41010-026 | |
| L-glutamine | Sigma | G7513 | |
| penicillin/streptomycin | Sigma | P4333 | |
| 0.4μm culture insert | Millipore | PICM0RG50 | |
| TSS20 Ovodyne electroporator | Intracel | 01-916-02 | Use 3x10v, 10ms pulses for electroporation. |
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