Ex vivo Culture of Chick lillehjernen Slices og Romlig Målrettet Electroporation av granulat Cell Forstadier

Summary

Lillehjernen eksterne granulat laget er åsted for det største transitt forsterkning i utviklingen av hjernen. Her presenterer vi en protokoll for å målrette genmodifisering til dette laget på toppen av spredning ved hjelp av ex vivo elektroporering og kulturen i lillehjernen skiver fra embryonale Day 14 kyllingfoster.

Abstract

Lillehjernen eksterne granule lag (EGL) er stedet for den største transitt forsterkning i utviklingen av hjernen, og en utmerket modell for å studere neuronal spredning og differensiering. I tillegg er det evolusjonære modifikasjoner av den proliferative evne vært ansvarlig for den dramatiske utvidelse av lillehjernen størrelse i amniotes, noe som gjør cerebellum en utmerket modell for evo-Devo studier av virveldyr hjernen. Konstituerende cellene i EGL, lillehjernen granule stamfedre, også representerer en betydelig celle utstedt medulloblastoma, den mest utbredte pediatrisk nevronale svulst. Etter sin vei forsterkning, granule forløpere migrere radielt inn i den indre granulære lag av lillehjernen, hvor de representerer den største neuronal populasjon i den modne hjernen hos pattedyr. I chick, oppstår toppen av EGL proliferasjon mot slutten av den andre uken av drektighetsperioden. For å målrette genetisk modifisering av dette lag vedtoppen av spredning, har vi utviklet en metode for genetisk manipulasjon gjennom ex vivo elektroporering av lillehjernen skiver fra embryonale Day 14 kyllingfoster. Denne metoden sammenfatter flere viktige sider ved in vivo granule neuron utvikling og vil være nyttig i å generere en grundig forståelse av cerebellar granule celleproliferasjon og differensiering, og dermed av cerebellum utvikling, evolusjon og sykdom.

Introduction

Lillehjernen sitter på fremre enden av hindbrain og er ansvarlig for integrering av sensorisk og motorisk behandling i modne hjernen samt regulere høyere kognitive prosesser ^1. I pattedyr og fugler, besitter det en forseggjort morfologi og er tungt foliert, et produkt fra transitt omfattende forsterkning av progenitorceller under utvikling som produserer over halvparten av nervecellene i den voksne hjernen. Lillehjernen har vært gjenstand for studier for nevrobiologer i århundrer og i molekylær epoken har også fått betydelig oppmerksomhet. Dette gjelder ikke bare for sin iboende interessant biologi, men også til det faktum at det er sterkt implisert i human sykdom inkludert utviklings genetiske lidelser så som autisme ^{2 og} er mest fremtredende i cerebellar kreft, medulloblastom ^3, som er den mest utbredte pediatriske hjerne svulst. Viktigst er det en utmerket modell system innen which å studere skjebnen tildeling og neurogenesis under hjernens utvikling ^4. I de senere årene har det også blitt etablert som et modellsystem for sammenlignende studie av hjernens utvikling, på grunn av den enorme mangfoldet av lillehjernen former sett over virveldyr fylogeni ^5-10.

Lillehjernen utvikler seg fra rygghalvparten av rhombomere en i hindbrain ¹¹ og utviklingsmessig består av to primære progenitor populasjoner, rombe leppen og ventrikulær sone. Den rhombic leppe strekker seg rundt rygg regionen i neuroepithelium av hindbrain på grensen med taket plate. Det er fødestedet til de glutamaterge eksitatoriske nevroner i lillehjernen ^12-14. Ventrikulære sonen gir opphav til de hemmende gabaergic cerebellare nevroner, mest fremtredende de store Purkinje nevroner ^14,15. Senere i utvikling (fra ca embryonale dag 13,5 i mus, e6 i chick ^16), glutamatergic Progenitors migrere tangentielt fra rhombic leppe og danne et pial lag av stamfedre: en sekundær stamfar sone kalt ekstern granulat lag (EGL). Det er dette laget som gjennomgår omfattende transitt forsterkning som fører til det store antallet granule nevroner som finnes i den modne hjernen.

Spredning i EGL har lenge vært knyttet til sub-pial sted at resultatene fra tangential migrasjon fra rhombic leppe ^17, med bryteren til cellesyklusen exit og nevronale differensiering av stamceller bli assosiert med sin exit fra det ytre EGL lag i midten EGL ^18. Omfattende tangentiell migrering av post-mitotiske granule celler i medial-lateral akse forekommer i den midtre og indre EGL ^19, før den endelige radial migrering inn i det indre granulat laget av modne lillehjernen cortex. Migrering av celler fra rombisk leppen over cerebellar overflaten er avhengig av signalering fra CXCL12 pia ^20-22 </sup> Og granule celler uttrykker CXCL12 reseptoren CXCR4. Deres tangential migrasjon er dermed minner om at av neokortikale tangentielt migrere hemmende Interneuron populasjoner ^23-25. Forbløffende nok elektron mikroskopiske studier ¹⁷ har antydet at EGL celler med en proliferativ morfologi opprett pial kontakt, linking celle atferd med proliferativ kapasitet på en måte som minner om de basale stamfedre av pattedyr cortex ^26. Dette gjenspeiles i den ovenfor nevnte lagdeling av EGL i tre sjikt som er definert av forskjellige ekstracellulære omgivelser og hvor granule forløpere adskilte genekspresjon ¹⁸ signaturer.

Proliferasjon av progenitorceller i oEGL oppstår med en normal fordeling av klone størrelser, slik at når forløpere er individuelt genetisk merket i enden av embryoutvikling i mus, gir de opphav til en median gjennomsnitt på 250-500 g postmitoticranule nevroner ^27,28. Spredning er avhengig mitogent SHH signale fra underliggende Purkinjefibrene nevroner ^29-32. Evnen til å reagere på SHH har vist seg å være helt avhengig av celleautonome ekspresjonen av transkripsjonsfaktor Atoh1, både in vitro og ³³ in vivo ^34,35. Likeledes har cellesyklus utgang og differensiering blitt vist å være avhengig av ekspresjonen av den nedstrøms transkripsjonsfaktor NeuroD1 ^36, som mest sannsynlig et direkte repressor av Atoh1 ^37.

Til tross for denne utviklingen, og et betydelig fremskritt i å tyde cellen biologisk basis av cellesyklus utgang ^38-42, til den grunnleggende molekylære mekanismen (e) som ligger til grunn for avgjørelsen avslutter cellesyklus og å gå over fra en progenitor til en differensierende neuron, og tilhørende postmitotic tangentiell migrasjon i den indre EGL, så vel som den senere bryterentil radial migrasjon, forblir ufullstendig forstått. Dette er i stor grad på grunn av den eksperimentelle intractability av EGL: det er forsinket utvikling, og er vanskelig å målrette genetisk siden mange av de samme nevrogene molekyler er også avgjørende tidligere i livet av granule forløpere ved rhombic leppe. For å overvinne dette problemet, har mange forfattere utviklet in vivo og ex vivo elektroporering som en metode for å målrette barsel cerebellum hos gnagere ^43-48. Her har vi pioner bruk av ex vivo elektroporering i chick å studere EGL, som representerer betydelige fordeler i form av pris og brukervennlighet. Vår metode for elektroporering og ex vivo skive kultur av chick lillehjernen vev anvendelser vev dissekert fra embryonale Day 14 unger på toppen av EGL spredning. Denne metoden gjør genetisk målretting av EGL uavhengig av rhombic leppe og vil sette scenen for genetisk disseksjon av overgangen fra granulatstamfar til postmitotic granulat nevron i lillehjernen.

Protocol

Merk: Alle forsøkene ble utført med henhold til Kings College London, UK og retningslinjene UK hjemmekontoret dyr omsorg. 1. Disseksjon av e14 lillehjernen Inkuber brune befruktede hønseegg ved 38 ° C til embryonale dag 14. Bruke egg saks halshogge chick embryo i ovo og fjerne hodet til en petriskål med iskald PBS (figur 1A). Ved hjelp av standard tang, lage snitt bak hvert øye hele veien gjennom vevet, fjerne øyne og øvre kjev…

Representative Results

Denne delen viser eksempler på resultater som kan oppnås ved hjelp av slice elektroporering og kulturen i lillehjernen fra embryonale Dag 14 chick. Disseksjon av lillehjernen er illustrert i figur 1 og elektroporering kammeret satt opp er vist i figur 2. Vi viser at det er mulig å electroporate og hell kultur cerebellare stykker, som beholder sin struktur og cellulære morfologi in vitro (figur</e…

Discussion

Protokollen rapportert her beskriver en metode for å dissekere, electroporating og dyrking skiver av embryonale Dag 14 cerebellum fra dama. Denne protokollen muliggjør målretting av elektroporering til små fokus regioner av EGL, inkludert isolerte målretting av individuelle lillehjernen fliker. Det gjør det mulig genetisk analyse og bildebehandling med høy oppløsning og bekvemmelighet, og til en lav pris i forhold til etablerte teknikker i gnagere ^43-47. En slik analyse er foreløpig ikke mulig in…

Materials

McIlwain tissue chopper	Mickle Laboratory Engineering Ltd		Cut at 300μm for best results.
Basal Medium Eagle (Gibco)	Life Technologies	41010-026
L-glutamine	Sigma	G7513
penicillin/streptomycin	Sigma	P4333
0.4μm culture insert	Millipore	PICM0RG50
TSS20 Ovodyne electroporator	Intracel	01-916-02	Use 3x10v, 10ms pulses for electroporation.