Ex vivo Kultur av Chick Cerebellar skivor och rumsligt riktade elektroporering av Granulat cellprekursorer

Summary

Lillhjärnan yttre granulskiktet är platsen för den största transit förstärkningen i den växande hjärnan. Här presenterar vi ett protokoll för att rikta genetisk modifiering till detta skikt på toppen av spridning med hjälp av ex vivo elektroporering och kultur cerebellär skivor från embryonala dag 14 kycklingembryon.

Abstract

Lillhjärnan yttre granulskiktet (EGL) är platsen för den största transit förstärkningen i den växande hjärnan, och en utmärkt modell för att studera neuronal proliferation och differentiering. Dessutom har evolutionära förändringar av sin proliferativa förmåga varit ansvarig för den dramatiska expansionen av cerebellär storlek i amnioternas, vilket gör lillhjärnan en utmärkt modell för evo-devo studier av ryggradsdjur hjärnan. De ingående cellerna i EGL, cerebellära granulatföregångare, också utgöra en betydande cell ursprungs för medulloblastom, den vanligaste pediatriska neuronal tumör. Efter att ha passerat förstärkning, granulat prekursorer migrerar radiellt i den inre granulära skiktet av lillhjärnan där de utgör den största neuronala befolkningen i den mogna däggdjurshjärnan. I chick inträffar toppen av EGL spridning i slutet av den andra graviditetsveckan. För att rikta genetisk modifiering till detta skikt påtoppen av spridning, har vi utvecklat en metod för genetisk manipulation genom ex vivo elektroporering av cerebellum skivor från embryonala dag 14 kycklingembryon. Denna metod rekapitulerar flera viktiga aspekter av in vivo granulat neuron utveckling och kommer att vara användbara för att generera en grundlig förståelse av cerebellär granulat celltillväxt och differentiering, och därmed lillhjärnan utveckling, evolution och sjukdom.

Introduction

Lillhjärnan sitter vid den främre änden av hindbrain och är ansvarig för integrationen av sensorisk och motorisk bearbetning i den mogna hjärnan samt reglering högre kognitiva processer ^1. I däggdjur och fåglar, besitter det en utarbetad morfologi och är kraftigt folierade, en produkt från omfattande transit amplifiering av progenitorer under utvecklingen som producerar över hälften av nervceller i den vuxna hjärnan. Lillhjärnan har varit föremål för undersökning för neurobiologists i århundraden och den molekylära eran har också fått stor uppmärksamhet. Detta gäller inte bara dess inneboende intressanta biologi, men också till det faktum att det är starkt inblandad i mänskliga sjukdomar inklusive utvecklings genetiska störningar såsom autismspektrumstörningar ² och mest framträdande lillhjärnan cancer, medulloblastom ^3, vilket är den vanligaste barn hjärna tumör. Viktigt är det ett utmärkt modellsystem inom which att studera ödet tilldelning och neurogenes under hjärnans utveckling ^4. Under de senaste åren har det också etablerats som ett modellsystem för jämförande studie av hjärnans utveckling, på grund av den enorma mångfald av cerebellära former ses över ryggradsdjur fylogeni ^5-10.

Lillhjärnan utvecklas från den dorsala halv av rhombomere en i bakhjäman ¹¹ och utvecklingsmässigt består av två primära gångarpopulationer, den rombiska läppen och den ventrikulära zonen. Den rombiska läpp sträcker sig runt rygg regionen av neuroepithelium av bakhjäman vid gränsen med takplåt. Det är födelseplatsen för de glutamaterg excitatoriska nervceller i lillhjärnan ^12-14. Den ventrikulära zonen ger upphov till de hämmande GABAergic cerebellära neuroner, framförallt de stora Purkinje nervceller ^14,15. Senare under utveckling (från ca embryonala dag 13,5 i mus, e6 i chick ^16), glutamaterga Progennärer migrera tangentiellt från rombiska läppen och bildar en pial lager av stamceller: en sekundär stamfader zon kallas yttre granulskiktet (EGL). Det är detta skikt som genomgår omfattande transit förstärkning som leder till det stora antalet granulära neuroner som finns i den mogna hjärnan.

Spridning i EGL har länge kopplats samman med under pial plats som resultat av tangent migrering från rombiska läppen ^17, med övergången till cellcykeln exit och neuronal differentiering av stamceller som i samband med deras utträde ur yttre EGL skiktet i mitten EGL ^18. Omfattande tangentiell migration av post mitotiska granulceller i medial-lateral axel uppträder i mitten och inre EGL ^19, före slutlig radiell migrering in i det inre granulatskiktet av det mogna cerebellär cortex. Migration av celler från rombiska läpp över lillhjärnan ytan är beroende av CXCL12 signalering från Pia ^20-22 </sup> Och granulceller uttrycker CXCL12 receptorn CXCR4. Deras tangentiell migration är således påminner om den hos hjärnbarkens tangentiellt migrera hämmande interneuronen populationer ^23-25. Intressant, elektronmikroskopiska undersökningar ¹⁷ har föreslagit att EGL celler med en proliferativ morfologi hålla pial kontakt förbinder cellens beteende med proliferativ kapacitet på ett sätt som påminner om de basala stamfäder för däggdjurs cortex ^26. Detta återspeglas i den tidigare nämnda skiktning av EGL i tre underskikt som definieras av olika extracellulära miljöer och där granulat prekursorer har distinkta genuttryck signaturer ^18.

Proliferation av progenitorceller i oEGL inträffar med en normal fördelning av klon storlekar så att när progenitorer är individuellt genetiskt märkt vid slutet av embryonal utveckling hos mus, ger de upphov till en median genomsnitt 250-500 postmitotisk granule neuroner ^27,28. Spridning är beroende av mitogen SHH signalering från underliggande Purkinje neuroner ^29-32. Förmågan att svara på SHH har visat sig vara helt beroende av cell självständig uttryck av transkriptionsfaktorn Atoh1, både in vitro ³³ och in vivo ^34,35. På samma sätt har cellcykel exit och differentiering visats vara beroende av expressionen av nedströms transkriptionsfaktorn NeuroD1 ^36, vilket sannolikt direkt repressor Atoh1 ^37.

Trots dessa framsteg, och betydande framsteg i att dechiffrera cellen biologiska grunden för cellcykel exit ^38-42, den grundläggande molekylära mekanismen (s) som ligger till grund för beslutet lämna cellcykeln och att övergå från en föregångare till en differentierande neuron, och tillhörande postmitotisk tangentiell migration i den inre EGL liksom senare switchradiell migration, fortfarande ofullständigt känd. Detta är till stor del på grund av den experimentella intractability av EGL: det är sent utveckling, och svåra att rikta genetiskt eftersom många av samma neurogena molekylerna är också avgörande tidigare i livet av granulat prekursorer på rombiska läppen. För att övervinna detta problem, har talrika författare utvecklats in vivo och ex vivo elektroporering som en metod för att rikta den postnatala cerebellum hos gnagare ^43-48. Här, vi pionjär användningen av ex vivo elektroporering i chick att studera EGL, som representerar betydande fördelar i fråga om kostnader och bekvämlighet. Vår metod för elektroporering och ex vivo bit kultur av chick cerebellär vävnad använder vävnad dissekerades från embryonala dag 14 kycklingar på toppen av EGL spridning. Denna metod tillåter genetisk riktat EGL oberoende av rombiska läppen och kommer att sätta scenen för genetisk dissektion av övergången från granulatstamfader till postmitotisk granulat neuron i lillhjärnan.

Protocol

Obs: Alla experiment utfördes med enlighet med Kings College London, Storbritannien och riktlinjerna för brittiska hemmakontoret djurskötsel. 1. Dissektion av e14 Cerebellum Inkubera brun befruktade hönsägg vid 38 ° C till embryonal dag 14. Använda ägg sax halshugga kycklingembryo in ovo och ta bort huvudet till en petriskål med iskall PBS (Figur 1A). Med användning av standard pincett, gör snitt bakom varje öga hela vägen…

Representative Results

Det här avsnittet visar exempel på resultat som kan uppnås med hjälp av skiva elektroporering och kultur av lillhjärnan från embryonala dag 14 chick. Dissektionen av lillhjärnan illustreras i figur 1 och elektroporeringskammaren inrättat visas i figur 2. Vi visar att det är möjligt att elektroporera och framgångsrikt kultur cerebellära segment, som bibehåller deras struktur och cellulära morfologier in …

Discussion

Protokollet redovisas här beskriver en metod för att dissekera, electroporating och odling skivor embryonala dag 14 lillhjärnan från ungen. Detta protokoll möjliggör målsökning av elektroporering till små bränn regioner i EGL, inklusive isolerade inriktning på enskilda cerebellära lober. Det möjliggör genetisk analys och bildbehandling med hög upplösning och bekvämlighet, och till en låg kostnad jämfört med etablerade tekniker i gnagare ^43-47. En sådan analys är för närvarande inte mö…

Materials

McIlwain tissue chopper	Mickle Laboratory Engineering Ltd		Cut at 300μm for best results.
Basal Medium Eagle (Gibco)	Life Technologies	41010-026
L-glutamine	Sigma	G7513
penicillin/streptomycin	Sigma	P4333
0.4μm culture insert	Millipore	PICM0RG50
TSS20 Ovodyne electroporator	Intracel	01-916-02	Use 3x10v, 10ms pulses for electroporation.