シロイヌナズナタンパク質-DNA相互作用の同定のための免疫沈降アッセイクロマチン<em>インビボ</em
Summary
クロマチン免疫沈降は、DNAは、インビボでのシロイヌナズナのタンパク質の結合部位を同定するための強力な技術です。この手順は、クロマチン架橋および断片化、目的のタンパク質に対する選択的な抗体を用いた免疫沈降、および結合したDNAの定量PCR分析を含みます。私たちは、シロイヌナズナ植物用に最適化され、単純なChIPアッセイを説明します。
Abstract
Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and silencing of genes mediate the response of plants to environmental signals and developmental cues. Therefore, insights into the mechanisms that control plant gene expression are essential to gain a deep understanding of how biological processes are regulated in plants. The chromatin immunoprecipitation (ChIP) technique described here is a procedure to identify the DNA-binding sites of proteins in genes or genomic regions of the model species Arabidopsis thaliana. The interactions with DNA of proteins of interest such as transcription factors, chromatin proteins or posttranslationally modified versions of histones can be efficiently analyzed with the ChIP protocol. This method is based on the fixation of protein-DNA interactions in vivo, random fragmentation of chromatin, immunoprecipitation of protein-DNA complexes with specific antibodies, and quantification of the DNA associated with the protein of interest by PCR techniques. The use of this methodology in Arabidopsis has contributed significantly to unveil transcriptional regulatory mechanisms that control a variety of plant biological processes. This approach allowed the identification of the binding sites of the Arabidopsis chromatin protein EBS to regulatory regions of the master gene of flowering FT. The impact of this protein in the accumulation of particular histone marks in the genomic region of FT was also revealed through ChIP analysis.
Introduction
近年中に、分子遺伝学的ツールおよびゲノムの広い範囲は、モデル種のシロイヌナズナで開発されてきました。この技術は、植物の開発が規制されている方法を理解する上で非常に進歩を促進してきました。モデルとしてシロイヌナズナを用いて研究し、発達過程の中で、開花時期の遺伝的制御が広範囲に解析されています。これらの研究は、植物は非常に正確にそのようなホルモンや植物の年齢などの内因性手がかりに、また季節1の自然なサイクルで開花時期を同期させるような日長や温度などの環境シグナルに応答して開花時期を調節することが示されています2。開花の時間変化を有するシロイヌナズナ変異体の単離および特性は、内因性および環境要因に応じて開花時期を調節する遺伝子の複雑なネットワークを発表における決定要因となっています。これらの遺伝子回路は、開花のスイッチとして機能するいくつかのマスター遺伝子のレベルで統合され、花芽の正確なタイミングは、開花促進し、花のインテグレータ遺伝子1,3の上流に働くの活動を抑制するのバランスに依存しています。
ゲノムアプローチの最近の使用によって支援開花開始の制御におけるその役割のために同定された遺伝子の機能解析は、開花時期の調節における転写制御の中心的な役割を明らかにしました。実際には、開花エンコード転写のマスター遺伝子の多くは、4因子 。また、クロマチンリモデリングタンパク質複合体の数は、開花のマスター遺伝子の発現に影響を与えます。それらの変化した開花時のために単離さシロイヌナズナ変異体の数は、クロマチン修飾因子の様々なコード化する遺伝子に変異を有することが判明しました。ヒストンで翻訳後修飾を導入異なるクロマチン改築Eテール、ヒストンバリアントによって標準的なヒストンはシロイヌナズナ5,6の開花の適切なレギュレーションのために必要であるDNAまたは交換する相対ヌクレオソームの位置を変更します。これらのクロマチンリモデリング活動のいくつかは、特定のヒストン残基におけるアセチル化やメチル化などの共有結合修飾の堆積または除去を触媒します。これらのヒストンマークは特に開花遺伝子の転写活性を調節するために、他のクロマチンリモデリング複合体、転写因子または転写機構の成分を補充する特殊なエフェクターによって認識されます。
クロマチン免疫沈降（チップ）は、目的のタンパク質のためのin vivoでの DNA結合部位の同定（ 図1）ことができます。この手順は、DNAに架橋タンパク質の特定の化学物質の能力を利用します。得られたDNA-タンパク質複合体は、次いで、特異的抗体AGAを用いて免疫沈降することができ選択したタンパク質に結合instの転写因子、クロマチン結合タンパク質、または特定の改変および異種エピトープ（一般に「タグ」と呼ばれます）。これらの免疫沈降物から精製されたDNAは、目的の特定の配列の濃縮のために評価するために定量的PCR（定量PCR）反応における鋳型として使用することができます。この方法では、転写因子の結合部位または特定の遺伝子でのヒストンマークの分布が7,8を確立することができます。また、大規模並列シーケンシングを可能にする次世代シーケンシング（NGS）と合わせ、チップ技術は、転写因子の結合部位のゲノムワイドな識別だけでなく、ヒストン修飾の除幕式エピ風景を可能にしました。さらに、遺伝子発現の同時分析は、転写調節因子の結合または特定のヒストンマークの堆積は転写activiと相関方法をモニタリングできます遺伝子9のTY。
シロイヌナズナにおけるチッププロトコルの使用は、転写調節因子の様々な開花とどのようにこれらの構造変化は、遺伝子発現に影響を与える5,6のマスター遺伝子のクロマチン組織に与える影響を評価することができました。以前の結果は 、短い日でシロイヌナズナ遺伝子座早期抽苔 （EBS）は 、この遺伝子のショーに開花し、開花FTのマスター遺伝子のアップレギュレーションの加速度を開花し、変異体のリプレッサーとして機能することを示しました。また、FTにおける機能喪失型変異は完全にFTが EBS変異体の早期の開花およびEBS 10開花このマスター遺伝子の抑制のために必要であることが必要であることを示す、EBS変異体植物の初期開花表現型を抑制、11は、EBS は、具体的には 、ヒストンH3のジ-に結合し、目にすることができるトリメチルPHDを含むタンパク質をコードしますFT 12のクロマチン媒介抑制におけるEBSの役割を示唆している電子のリジン残基4（H3K4me2 / 3）、。 ChIPのアプローチの使用は、シロイヌナズナPHD含有タンパク質EBS 10,11は、その発現12を抑制するために花のインテグレータ遺伝子FTの調節領域に結合することを実証しました。チップ技術の使用によって得られる追加のデータは、このタンパク質は、シロイヌナズナの開発の初期段階で開花のこのマスター遺伝子のクロマチンにおけるヒストンアセチル化、活性な転写の顕著な特徴の低レベルを維持するために必要とされることを示しました。一緒に、遺伝子および遺伝子発現データを有するこれらの観察は、このシロイヌナズナPHD含有タンパク質は、花の積分FT遺伝子12の発現を調節することにより、開花時間の微調整において中心的な役割を有していることを示しています。ここで紹介する作品は、ヒストンの分析のためだけでなく、他のためだけでなく、有益な最適化された方法を提供し、タンパク質、および効率の向上と低下し、実験時間に関連するクロマチン。また、この報告書は、チップ・プロトコルの使用は、クロマチンの修飾の変化や植物遺伝子の転写状態、およびシロイヌナズナの開花の発症に遺伝子発現制御への影響をどのようにこれらのクロマチン媒介機構との関係に新たな洞察を提供している様子を示しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで説明のChIPプロトコールは、タンパク質およびアラビドプシス植物の in vivo での特定のDNA配列間の相互作用を分析するための再現可能かつ強力な技術です。目的のタンパク質の結合部位の同定に成功し、関連する相互作用が実際に行われている植物器官や発達段階を適切に選択する必要があります。また、植物材料の適切な固定および超音波処理によりクロマチンの最適な…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge The Plant Cell for allowing the use of some data published in this journal to elaborate the representative results described here in Figure 4. This work was supported by the EU 7FP Marie Curie-Initial Training Network EpiTRAITS (Grant Agreement 316965), and by the Spanish Ministerio de Economìa y Competitividad (grants BIO2010-15589 and BIO2013-43098-R).
Materials
| MES | Sigma | M8250 | |
| MS (Murashige and Skoog Basal Salt Mixture) | Sigma | M5524 | |
| Formaldehyde 37% | Sigma | F8775-25 | Use under the fume hood |
| Protease inhibitor mix cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EDTA-free, EASYpack | Roche | 5892791001 | |
| Bioruptor Standard sonication device | Diagenode | B01010002 (UCD200TO) | |
| Glycine | Sigma | 50046 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Dynabeads® magnetic beads coupled with protein A or protein G | Life Technologies | 10003D/10001D | Check manufacturer’s manual for antibody affinity |
| Miracloth | Merck Millipore | 475855 | |
| Triton™ X-100 Surfact-Amps™ Detergent Solution | Life Technologies | 85112 | |
| (mouse, rat, rabbit…)-IgG | Diagenode | C15400001, C15420001, C15410206 | |
| Magnetic rack – DynaMag™-2 | Life Technologies | 12321D | |
| H3K9/14ac polyclonal antibody – Premium | Diagenode | C15410200-10 | |
| Chelex® 100 Resin | Bio-Rad | 142-2832 | |
| Proteinase K | Life Technologies | 17916 | |
| Anti-Myc Tag Antibody, clone 4A6 | Millipore | 05-724 | |
| LightCycler® 480 SYBR Green I Master | Roche | 4707516001 |
Riferimenti
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