Murine Dermal Fibroblast Isolation ved FACS
Summary
Fibroblast behavior underlies a spectrum of clinical entities, but they remain poorly characterized, largely due to their inherent heterogeneity. Traditional fibroblast research relies upon in vitro manipulation, masking in vivo fibroblast behavior. We describe a FACS-based protocol for the isolation of mouse skin fibroblasts that does not require cell culture.
Abstract
Fibroblaster er princippet celletype ansvarlig for secernerende ekstracellulær matrix og er en kritisk komponent i mange organer og væv. Fibroblast fysiologi og patologi til grund et spektrum af kliniske enheder, herunder fibroser i flere organer, hypertrofisk ardannelse efter brandsår, tab af hjertefunktion efter iskæmi, og dannelsen af kræft stroma. Men fibroblaster stadig en dårligt karakteriseret type celle, hovedsagelig på grund af deres iboende heterogenitet. Eksisterende metoder til isolering af fibroblaster kræver tid i cellekultur, som har dybtgående indflydelse cellefænotype og adfærd. Derfor mange undersøgelser der undersøger fibroblast biologi stole på in vitro-manipulation og ikke præcist indfange fibroblast adfærd in vivo. For at overvinde dette problem har vi udviklet et FACS-baseret protokol til isolering af fibroblaster fra den dorsale hud voksne mus, der ikke kræver cellekultur, hvorved preserving den fysiologiske transkriptions- og proteomprofilen af hver celle. Vores strategi giver mulighed for udelukkelse af ikke-mesenkymale slægter via en slægt negativ gate (Lin -) i stedet for en positiv markering strategi for at undgå forudgående udvælgelse eller berigelse af en delpopulation af fibroblaster udtrykker specifikke overflademarkører og være så omfattende som muligt på tværs af denne heterogene celletype.
Introduction
Fibroblaster ofte defineres morfologisk som spindel-formede celler, der overholder plastsubstrater. Fibroblaster er princippet celletype ansvarlig for syntese og remodeling den ekstracellulære matrix i embryoniske og voksne organer 1. Fibroblaster er således afgørende for udviklingen af pattedyr og bidrager væsentligt til det ekstracellulære miljø, der påvirker adfærd nabolandet celletyper til stede i hvert væv og orgel.
Fibroblaster er også den primære celletype bag et bredt sæt af medicinske tilstande, der forårsager enorme klinisk byrde. Patologisk fibroblast aktivitet forringer normalt væv funktion og omfatter væv og organfibrose (såsom lunge og lever), ardannelse efter kutan sårheling, atherosklerose, systemisk sklerose, og dannelse af atheromatøse plaques efter blodkarbeskadigelse 2-5. Sårheling i særdeleshed, både akut og kronisk, involverer deposition af arvæv at hverken Ligner eller funktioner som det normale væv omkring det, og fører til betydelig sygelighed på tværs af forskellige patologiske tilstande. Efter skade, der er en overgang af fibroblaster til myofibroblaster, som derefter udskiller strukturelle ECM komponenter, udøver paracrine virkninger på nærliggende celletyper, og genoprette mekanisk stabilitet ved at deponere arvæv 6.
I kutane væv findes der betydelig variation i kvaliteten af sårreparation tværs udviklingsmæssige tid og mellem anatomiske steder. I de første to trimestre af livet fosteret heler uden ardannelse; Men fra den tredje trimester, og gennem hele voksenlivet, mennesker helbrede med et ar. Stedspecifik, udover aldersspecifikke er der forskelle i sårheling. Sår i mundhulen remodel med minimal ardannelse 7,8, mens arvæv deponering inden kutane sår er væsentlig 9. Kontrovers fortsætter concerning den relative påvirkning af miljøet versus iboende egenskaber lokale fibroblaster om resultaterne af sårheling med hensyn til både alder og placering 10,11. I betragtning af de betydelige forskelle i helbredelsen af mus oral vs kutane dermis og tidligere embryonale (E15) vs. senere embryonale (E18) dermis, er det sandsynligt, at iboende forskelle i populationer af fibroblaster på bestemte udviklingsmæssige aldre, og mellem forskellige anatomiske steder eksisterer .
I 1986 Harold F. Dvorak posited tumorer er sår, der ikke heler 12. Dvorak konkluderede, at tumorer opfører sig som sår i kroppen og fremkalde deres stroma ved at aktivere sårheling respons af værten. Talrige undersøgelser har siden undersøgt bidrag fibroblaster til progression af carcinomer 13-15, men som i tilfælde af sårheling, identitet og embryonale oprindelse af fibroblaster, der bidrager til det stromale rum af kutan carcinomas er ikke defineret tilstrækkeligt. Svaret på dette spørgsmål bærer medicinsk relevans givet de seneste undersøgelser udsætter tumor-associerede fibroblast som et potentielt effektivt mål for anti-cancer-terapi 16.
Identificering og fremadrettet isolere fibroblast slægter udstyret med fibrogene potentiale in vivo er et vigtigt skridt i retning af en effektiv manipulere deres reaktion på skade på tværs af en bred vifte af akutte og kroniske sygdomstilstande. I 1987 Cormack demonstrerede to subpopulationer af fibroblaster, en bosiddende i papillære og én inden for de retikulære dermis 17,18. En tredje subpopulation blev fundet associeret med hårsække i hudpapillen region folliklen 19,20. Når dyrkes, disse fibroblast undertyper udviser forskelle i vækstmuligheder, morfologi, og vækstfaktor / cytokiner profiler 21-24.
Til dato studier undersøger fibroblast hanterogeneity har i vid udstrækning undladt i tilstrækkelig grad karakterisere udviklingsmæssige og funktionel mangfoldighed blandt fibroblaster in vivo. Dette er delvis et resultat af en afhængighed af dyrkede fibroblast populationer og homogenisering virkning af cellekultur eller positiv selektion på grundlag af en selvstændig overfladereceptor ikke udtrykkes af alle fibroblaster 25. En nylig undersøgelse fra vores laboratorium viste en dybtgående overflade markør og transkriptionel skift i dyrkede fibroblaster vs. dyrkede isoleret ved FACS-baserede isolation metode præsenteres i dette håndskrift 26.
Efterfølgende har vi identificeret en specifik fibroblast afstamning inden for de murine dorsale dermis og fastslået, at dette afstamning, defineret ved embryonale udtryk for Engrailed-1, er hovedansvarlig for bindevæv aflejring i dorsale hud. Afstamning funktioner under både akutte og kroniske former for fibrose, herunder sårheling, cancer stromadannelse ogstrålingsinduceret fibrose 27. Karakterisering af forskellige fibroblast slægter har kritiske konsekvenser for behandlinger der tager sigte på at modulere fibrogene adfærd.
Snarere end at bruge eksisterende protokoller, der er baseret på in vitro-manipulation for at opnå celleisolering 28,29, vil høsten protokollen (figur 1) beskrevet her hjælpe yield informative analyser af fibroblaster, som mere præcist afspejler fænotype og adfærd in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Beskrevet i dette manuskript protokol giver et middel til at isolere fibroblaster ved FACS-sortering baseret, i forhold til de eksisterende metoder, som enten vælger for en subpopulation eller kræver tid i cellekultur, før de efterfølgende analyser. Den tid, der kræves fra høst af huden til sortering af fibroblaster er ca. 6 timer; dog vil antallet af mus anvendt i høsten påvirke dette skøn.
Flere punkter i protokollen kræver særlig pleje. Den første er begrænsende adipocyt foru…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet delvist af en bevilling fra NIH tilskud R01 GM087609 (til HPL), en gave fra Ingrid Lai og Bill Shu til ære for Anthony Shu (til HPL), NIH tilskud U01 HL099776 (til MTL), den Hagey Laboratoriet for Pediatric regenerativ medicin og The Oak Foundation (til MTL, GCG og HPL). GGW blev støttet af Stanford School of Medicine, Stanford Medical Scientist Training Program, og NIGMS uddannelse tilskud GM07365. ZNM blev støttet af plastikkirurgi Fondens Forskningsenhed Fellowship Grant og Hagey Family Fund. MSH blev støttet af California Institute for regenerativ medicin (CIRM) Klinisk Fellow uddannelse tilskud TG2-01159, American Society of Maxillofacial kirurger (ASMS) / maxillofacial kirurger Foundation (MSF) Research Grant Award, og transplantationen og Tissue Engineering Fellowship Award.
Materials
| Surgical Forceps | Kent Scientific | INS650916 | |
| Micro-scissors | Kent Scientific | INS600127 | |
| Povidone Iodine Prep Solution | Dynarex | 1415 | |
| Nair (depilatory cream) | Church and Dwight Co. | 22600267058 | |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | |
| Elastase | Abcam | ab95133 | |
| DMEM | Life Technologies | A14430-01 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000-044 | |
| Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) lysing buffer | Gibco | A10492-01 | |
| 40 micron filters | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| 70 micron filters | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| 100 micron filters | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| CD31 | BioLegend | 102421 | |
| CD45 | BioLegend | 103125 | |
| Tie2 | BioLegend | 124005 | |
| Ter-119 | BioLegend | 116233 | |
| EpCAM (CD326) | eBioscience | 48-5791 | |
| DAPI | Invitrogen | D3571 | |
| propidium iodide (PI viability stain) | BioLegend | 421301 |
Riferimenti
- Sorrell, J. M., Caplan, A. I. Fibroblasts-a diverse population at the center of it all. International review of cell and molecular biology. 276, 161-214 (2009).
- Wynn, T. A. Cellular and molecular mechanisms of fibrosis. The Journal of pathology. 214, 199-210 (2008).
- Powell, D. W., et al. Myofibroblasts. I. Paracrine cells important in health and disease. The American journal of physiology. 277, C1-C9 (1999).
- Wilson, M. S., Wynn, T. A. Pulmonary fibrosis: pathogenesis, etiology and regulation. Mucosal immunology. 2, 103-121 (2009).
- Hinz, B., et al. The myofibroblast: one function, multiple origins. The American journal of pathology. 170, 1807-1816 (2007).
- Li, B., Wang, J. H. Fibroblasts and myofibroblasts in wound healing: force generation and measurement. J Tissue Viability. 20, 108-120 (2011).
- Wong, J. W., et al. Wound healing in oral mucosa results in reduced scar formation as compared with skin: evidence from the red Duroc pig model and humans. Wound repair and regeneration : official publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 17, 717-729 (2009).
- Szpaderska, A. M., Zuckerman, J. D., DiPietro, L. A. Differential injury responses in oral mucosal and cutaneous wounds. Journal of dental research. 82, 621-626 (2003).
- Hantash, B. M., Zhao, L., Knowles, J. A., Lorenz, H. P. Adult and fetal wound healing. Frontiers in bioscience : a journal and virtual library. 13, 51-61 (2008).
- Buchanan, E. P., Longaker, M. T., Lorenz, H. P. Fetal skin wound healing. Advances in clinical chemistry. 48, 137-161 (2009).
- Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453, 314-321 (2008).
- Dvorak, H. F. Tumors: wounds that do not heal. Similarities between tumor stroma generation and wound healing. The New England journal of medicine. 315, 1650-1659 (1986).
- Dumont, N., et al. Breast fibroblasts modulate early dissemination, tumorigenesis, and metastasis through alteration of extracellular matrix characteristics. Neoplasia. 15, 249-262 (2013).
- Servais, C., Erez, N. From sentinel cells to inflammatory culprits: cancer-associated fibroblasts in tumour-related inflammation. The Journal of pathology. 229, 198-207 (2013).
- Orimo, A., Weinberg, R. A. Stromal fibroblasts in cancer: a novel tumor-promoting cell type. Cell cycle. 5, 1597-1601 (2006).
- Li, X., et al. Targeting the cancer-stroma interaction: a potential approach for pancreatic cancer treatment. Current pharmaceutical design. 18, 2404-2415 (2012).
- Sorrell, J. M., Caplan, A. I. Fibroblast heterogeneity: more than skin deep. Journal of cell science. 117, 667-675 (2004).
- Cormack, D. H. . Ham’s Histology. , 450-474 (1987).
- Jahoda, C. A., Reynolds, A. J. Dermal-epidermal interactions. Adult follicle-derived cell populations and hair growth. Dermatologic clinics. 14, 573-583 (1996).
- Jahoda, C. A., Reynolds, A. J. Hair follicle dermal sheath cells: unsung participants in wound healing. Lancet. 358, 1445-1448 (2001).
- Sorrell, J. M., Baber, M. A., Caplan, A. I. Construction of a bilayered dermal equivalent containing human papillary and reticular dermal fibroblasts: use of fluorescent vital dyes. Tissue engineering. 2, 39-49 (1996).
- Harper, R. A., Grove, G. Human skin fibroblasts derived from papillary and reticular dermis: differences in growth potential in vitro. Science. 204, 526-527 (1979).
- Schafer, I. A., Pandy, M., Ferguson, R., Davis, B. R. Comparative observation of fibroblasts derived from the papillary and reticular dermis of infants and adults: growth kinetics, packing density at confluence and surface morphology. Mechanisms of ageing and development. 31, 275-293 (1985).
- Sorrell, J. M., Baber, M. A., Caplan, A. I. Site-matched papillary and reticular human dermal fibroblasts differ in their release of specific growth factors/cytokines and in their interaction with keratinocytes. Journal of cellular physiology. 200, 134-145 (2004).
- Sharon, Y., Alon, L., Glanz, S., Servais, C., Erez, N. Isolation of normal and cancer-associated fibroblasts from fresh tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). Journal of visualized experiments : JoVE. , e4425 (2013).
- Walmsley, G. G., et al. Live Fibroblast Harvest Reveals Surface Marker Shift in vitro. Tissue engineering. Part C, Methods. , (2014).
- Rinkevich, Y., Walmsley, G. G., Hu, M. S., Maan, Z. N., Newman, A. M., Drukker, M., Januszyk, M., Krampitz, G. W., Gurtner, G. C., Lorenz, H. P., Weissman, I. L., Longaker, M. T. Identification and Isolation of a Dermal Lineage with Intrinsic Fibrogenic Potential. Science. , (2015).
- Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents. J Vis Exp. , (2010).
- Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice. Nature protocols. 3, 799-810 (2008).
- Klein, M., Fitzgerald, L. R. Enzymatic separation of intact epidermal sheets from mouse skin. The Journal of investigative dermatology. 39, 111-114 (1962).
- Biburger, M., Trenkwald, I., Nimmerjahn, F. yThree blocks are not enough – Blocking of the murine IgG receptor FcgammaRIV is crucial for proper characterization of cells by FACS analysis. European journal of immunology. , (2015).
