Murine Hautfibroblasten-Isolation durch FACS
Summary
Fibroblast behavior underlies a spectrum of clinical entities, but they remain poorly characterized, largely due to their inherent heterogeneity. Traditional fibroblast research relies upon in vitro manipulation, masking in vivo fibroblast behavior. We describe a FACS-based protocol for the isolation of mouse skin fibroblasts that does not require cell culture.
Abstract
Fibroblasten sind die Hauptzelltyp für die Sekretion der extrazellulären Matrix verantwortlich sind und eine wichtige Komponente vieler Organe und Gewebe. Fibroblast Physiologie und Pathologie zugrunde ein Spektrum von klinischen Einrichtungen, einschließlich Fibrosen in mehreren Organen, hypertrophe Narben nach Verbrennungen, Verlust der Herzfunktion nach Ischämie und der Krebsentstehung ein Stroma. Allerdings bleiben Fibroblasten ein schlecht charakterisierte Zelltyp, vor allem wegen ihrer inhärenten Heterogenität. Bestehenden Verfahren für die Isolierung von Fibroblasten erfordern Zeit in Zellkultur, die grundlegend beeinflusst Zellphänotyps und Verhalten. Folglich sind viele Studien, die Fibroblasten biology beruhen auf in-vitro-Manipulation und nicht genau Fibroblasten Verhalten in vivo zu erfassen. Um dieses Problem zu überwinden, haben wir eine FACS-basiertes Protokoll entwickelt für die Isolierung von Fibroblasten aus der Rückenhaut von erwachsenen Mäusen, die Zellkultur nicht erfordert, wodurch preserving die physiologische Transkriptions-und Proteom-Profil jeder Zelle. Unsere Strategie ermöglicht Ausschluss nicht mesenchymale Linien über eine Linie negative Gate (Lin -) statt eines positiven Selektionsstrategie zur Vorauswahl oder Anreicherung von einer Subpopulation von Fibroblasten zu vermeiden Expression spezifischer Oberflächenmarker und werden so umfassend wie möglich über diese heterogenen Zelltyp.
Introduction
Fibroblasten werden oft morphologisch spindelförmigen Zellen, die auf Kunststoffsubstraten haften definiert. Fibroblasten sind das Prinzip Zelltyp für die Synthese und den Umbau der extrazellulären Matrix in embryonalen und adulten Organen 1 verantwortlich. Fibroblasten sind daher entscheidend für die Entwicklung von Säugetieren und tragen wesentlich zur extrazelluläre Milieu, das das Verhalten von benachbarten in jedem Gewebe und Organ vorliegenden Zelltypen beeinflußt.
Fibroblasten sind auch der Hauptzelltyp hinter eine vielfältige Reihe von medizinischen Bedingungen, die enorme klinische Belastung verursachen. Pathologische Fibroblastenaktivität beeinträchtigt die normale Gewebefunktion und umfasst Gewebe und Organfibrose (wie der Lunge und Leber), Narben nach kutaner Wundheilung, Atherosklerose, Sklerodermie und Bildung Atheromatoseplaques nach der Blutgefäßverletzung 2-5. Wundheilung insbesondere akut und chronisch sowohl beinhaltet deposition von Narbengewebe, die weder ähnelt auch Aufgaben wie das normale Gewebe umgibt, und führt zu einer signifikanten Morbidität über verschiedene pathologische Zustände. Nach Verletzung, gibt es einen Übergang von Fibroblasten zu Myofibroblasten, die dann sezerStruktur ECM Komponenten auszuüben parakrine Wirkungen auf benachbarten Zelltypen und Wiederherstellen mechanische Stabilität durch Abscheiden Narbengewebe 6.
In Hautgewebe besteht signifikante Abweichung in der Qualität der Wundreparatur in Entwicklungszeit zwischen anatomischen Stellen. In den ersten beiden Trimester des Lebens heilt der Fötus ohne Narbenbildung; jedoch von dem dritten Trimester auf und im Erwachsenenalter, Menschen heilen mit einer Narbe. Ortspezifische neben altersspezifische Unterschiede in der Wundheilung gibt. Wunden im Mundraum umzu mit minimaler Narbenbildung 7,8, während Narbengewebeablagerung innerhalb kutanen Wunden signifikant 9. Kontroverse besteht concerning den relativen Einfluss der Umwelt im Vergleich zu den intrinsischen Eigenschaften der lokalen Fibroblasten auf das Ergebnis der Wundheilung in Bezug auf sowohl Alter und Standort 10,11. Anbetracht der bedeutenden Unterschiede bei der Heilung von Maus oral vs. kutanen Dermis und früher embryonaler (E15) gegenüber späteren embryonalen (E18) Dermis, ist es wahrscheinlich, dass die intrinsische Unterschiede in den Populationen von Fibroblasten bei bestimmten Entwicklungs Alters und unter verschiedenen anatomischen Stellen existieren .
Im Jahr 1986, Harold F. Dvorak gesetzten Tumoren sind Wunden, die nicht heilen 12. Dvorak geschlossen, dass Tumoren verhalten sich wie Wunden im Körper und induzieren ihre Stroma durch Aktivieren der Wundheilungsreaktion des Wirts. Zahlreiche Studien haben seit sucht den Beitrag von Fibroblasten zur Progression von Karzinomen 13-15, aber wie im Falle der Wundheilung, die Identität und die embryonalen Ursprungs der Fibroblasten, die mit dem Stroma der kutanen ca beitragenrcinomas nicht ausreichend definiert. Die Antwort auf diese Frage trägt medizinische Relevanz angesichts der jüngsten Studien Aussetzen des Tumor-assoziierten Fibroblasten als potenziell wirksame Ziel für Anti-Krebs-Therapie 16.
Identifizierung und prospektiv Isolierung der Fibroblasten-Linien mit fibrogene Potenzial in vivo dotiert ist ein wesentlicher Schritt in Richtung ihrer Reaktion auf eine Verletzung in einem breiten Spektrum von akuten und chronischen Krankheitszuständen wirksam manipulieren. Im Jahr 1987 zeigte Cormack zwei Subpopulationen von Fibroblasten, einer mit Wohnsitz innerhalb der papillären und ein innerhalb der retikulären Dermis 17,18. Eine dritte Subpopulation gefunden wurde mit Haarfollikeln in der dermalen Papille Bereich des Follikels 19,20 verbunden. Wenn sie kultiviert werden, diese Fibroblasten-Subtypen zeigen Unterschiede in den Wachstumspotential, Morphologie und Wachstumsfaktor / Cytokine Profile 21-24.
Bisher Studien, Fibroblasten-erterogeneity weitgehend versäumt, angemessen zu Entwicklungs- und Funktionsvielfalt bei Fibroblasten in vivo. Dies ist teilweise ein Ergebnis einer Abhängigkeit von kultivierten Fibroblastenpopulationen und das homogenisierende Wirkung Zellkultur oder eine positive Selektion auf der Grundlage eines selbst-Oberflächenrezeptor nicht von allen Fibroblasten 25 ausgedrückt. Eine aktuelle Studie aus unserem Labor zeigten eine tiefgreifende Oberflächenmarker und Transkriptions-Verschiebung in kultivierten vs. uncultured Fibroblasten durch die FACS-basierte Isolierung Methodik in diesem Manuskript 26 präsentiert isoliert.
Anschließend identifizierten wir eine spezifische Fibroblastenlinie innerhalb der murine dorsal Dermis und bestimmt, dass diese Linie von embryonalen Expression des Engrailed-1 definiert ist, ist in erster Linie für Bindegewebsablagerung in die Rückenhaut verantwortlich. Die Linie Funktionen während der akuten und chronischen Formen der Fibrose einschließlich Wundheilung, Krebs Stromabildung undstrahleninduzierten Fibrose 27. Die Charakterisierung der verschiedenen Fibroblasten-Linien hat kritische Auswirkungen für Therapien, die auf die Modulation fibrogene Verhalten ausgerichtet.
Anstatt in einem der vorhandenen Protokolle, die auf In-vitro-Manipulation verlassen, um Zellisolierung 28,29 zu erreichen, wird die Ernte-Protokoll (Abbildung 1) detailliert hier Ausbeute informative Analysen von Fibroblasten, die mehr genau zu erfassen Phänotyp und Verhalten in vivo zu helfen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die in dieser Handschrift beschriebenen Protokoll bietet ein Mittel, um Fibroblasten durch FACS-basierte Sortierung zu isolieren, im Vergleich zu bestehenden Verfahren, die entweder wählen Sie für eine Teilgesamtheit oder erfordern Zeit in der Zellkultur vor der nachfolgenden Analysen. Die von der Ernte der Haut, um das Sortieren von Fibroblasten benötigte Zeit beträgt ca. 6 Stunden; jedoch wird die Anzahl der Mäuse in der Ernte verwendet diese Abschätzung beeinflussen.
Einige Punkte i…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde zum Teil durch einen Zuschuss aus NIH R01 GM087609 (HPL), ein Geschenk von Ingrid Lai und Bill Shu zu Ehren von Anthony Shu (HPL), NIH Zuschusses U01 HL099776 (MTL), der Hagey Laboratory for unterstützt Pediatric Regenerative Medizin und der Oak Foundation (bis MTL, GCG und HPL). GGW wurde von der Stanford School of Medicine, der Stanford Medical Scientist Training Program unterstützt und NIGMS Ausbildungsförderung GM07365. ZNM wurde von der Plastic Surgery Foundation Research Fellowship Grant und der Hagey Family Fund unterstützt. MSH wurde vom California Institute für Regenerative Medizin (CIRM) Clinical Fellow Ausbildungsförderung TG2-01159, der American Society of Kiefer-Gesichtschirurgen (ASMS) / MKG-Chirurgen Foundation (MSF) Research Grant Award und dem Transplant und Tissue Engineering Fellowship Award unterstützt.
Materials
| Surgical Forceps | Kent Scientific | INS650916 | |
| Micro-scissors | Kent Scientific | INS600127 | |
| Povidone Iodine Prep Solution | Dynarex | 1415 | |
| Nair (depilatory cream) | Church and Dwight Co. | 22600267058 | |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | |
| Elastase | Abcam | ab95133 | |
| DMEM | Life Technologies | A14430-01 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000-044 | |
| Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) lysing buffer | Gibco | A10492-01 | |
| 40 micron filters | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| 70 micron filters | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| 100 micron filters | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| CD31 | BioLegend | 102421 | |
| CD45 | BioLegend | 103125 | |
| Tie2 | BioLegend | 124005 | |
| Ter-119 | BioLegend | 116233 | |
| EpCAM (CD326) | eBioscience | 48-5791 | |
| DAPI | Invitrogen | D3571 | |
| propidium iodide (PI viability stain) | BioLegend | 421301 |
Riferimenti
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