FACS द्वारा murine चमड़े तंतुकोशिका अलगाव
Summary
Fibroblast behavior underlies a spectrum of clinical entities, but they remain poorly characterized, largely due to their inherent heterogeneity. Traditional fibroblast research relies upon in vitro manipulation, masking in vivo fibroblast behavior. We describe a FACS-based protocol for the isolation of mouse skin fibroblasts that does not require cell culture.
Abstract
Fibroblasts बाह्य मैट्रिक्स स्रावित के लिए जिम्मेदार सिद्धांत सेल प्रकार रहे हैं और कई अंगों और ऊतकों का एक महत्वपूर्ण घटक है। Fibroblast फिजियोलॉजी और विकृति कई अंगों में fibroses, हाईपरट्राफिक में घाव के निशान निम्नलिखित जलता है, ischemia निम्नलिखित हृदय समारोह की हानि, और कैंसर स्ट्रोमा के गठन सहित नैदानिक संस्थाओं की एक स्पेक्ट्रम कायम करना। हालांकि, fibroblasts के कारण बड़े पैमाने पर अपने निहित विविधता, सेल के एक खराब विशेषता प्रकार रहते हैं। Fibroblasts की अलगाव के लिए मौजूदा तरीकों को गहराई से सेल phenotype और व्यवहार को प्रभावित करती है कि सेल संस्कृति में समय की आवश्यकता है। नतीजतन, fibroblast जीव विज्ञान की जांच कई अध्ययनों में इन विट्रो हेरफेर पर भरोसा करते हैं और सही vivo में fibroblast व्यवहार पर कब्जा नहीं है। इस समस्या को दूर करने के लिए, हम preservi जिससे सेल संस्कृति की आवश्यकता नहीं है कि वयस्क चूहों के पृष्ठीय त्वचा से fibroblasts की अलगाव के लिए एक FACS आधारित प्रोटोकॉल विकसितशारीरिक ट्रांसक्रिप्शनल और प्रत्येक कोशिका के प्रोटिओमिक प्रोफ़ाइल एनजी। हमारी रणनीति एक वंश नकारात्मक गेट के माध्यम से गैर mesenchymal प्रजातियों के बहिष्कार के लिए अनुमति देता है (लिन -) बल्कि विशिष्ट सतह मार्करों व्यक्त fibroblasts की एक उप-जनसंख्या के पूर्व चयन या संवर्धन से बचने और इस विषम भर में संभव के रूप में समावेशी होने के लिए एक सकारात्मक चयन रणनीति से सेल प्रकार।
Introduction
Fibroblasts अक्सर प्लास्टिक substrates के लिए पालन करना है कि धुरी के आकार कोशिकाओं के रूप में आकृति विज्ञान परिभाषित कर रहे हैं। Fibroblasts synthesizing और भ्रूण और वयस्क अंगों 1 में बाह्य मैट्रिक्स remodeling के लिए जिम्मेदार सिद्धांत सेल प्रकार हैं। Fibroblasts स्तनधारी विकास के लिए इस प्रकार महत्वपूर्ण हैं और प्रत्येक ऊतक और अंग में मौजूद प्रकार की कोशिकाओं को पड़ोसी के व्यवहार को प्रभावित करती है कि बाह्य वातावरण के लिए काफी योगदान करते हैं।
Fibroblasts भी भारी नैदानिक बोझ का कारण है कि चिकित्सा की स्थिति की एक विविध सेट के पीछे प्रिंसिपल सेल प्रकार हैं। वैकृत fibroblast गतिविधि सामान्य ऊतक समारोह को बाधित और त्वचा संबंधी घाव भरने, atherosclerosis, प्रणालीगत काठिन्य, और रक्त वाहिनियों की चोट 2-5 के बाद atheromatous सजीले टुकड़े के गठन के बाद ऊतक (जैसे फेफड़े और यकृत के रूप में) अंग फाइब्रोसिस, scarring भी शामिल है। विशेष रूप से घाव भरने, दोनों तीव्रता और लंबे समय से, घ शामिलसामान्य ऊतकों की तरह न तो जैसा दिखता है और न ही कार्यों यह आसपास, और विविध वैकृत राज्यों में महत्वपूर्ण रुग्णता की ओर जाता है कि निशान ऊतक के eposition। चोट के बाद, फिर, संरचनात्मक ईसीएम घटकों छिपाना प्रकार की कोशिकाओं को पड़ोसी पर पैराक्राइन प्रभाव डालती है, और निशान ऊतक 6 जमा करके यांत्रिक स्थिरता बहाल जो myofibroblasts को fibroblasts की एक संक्रमण, वहाँ है।
त्वचीय ऊतकों में विकास समय के पार घाव की मरम्मत की गुणवत्ता में और शारीरिक साइटों के बीच महत्वपूर्ण भिन्नता मौजूद है। जीवन के पहले दो trimesters में भ्रूण scarring के बिना भर देता है; बहरहाल, पर और वयस्कता के दौरान तीसरी तिमाही से, एक निशान के साथ चंगा मानव। साइट विशेष, उम्र विशेष के अलावा, घाव भरने में मतभेद मौजूद हैं। त्वचा संबंधी घाव के भीतर निशान ऊतक बयान 9 महत्वपूर्ण है, जबकि मौखिक गुहा में घाव, कम से कम निशान गठन 7.8 के साथ फिर से तैयार करना। विवाद सी बनी रहती हैउम्र और स्थान 10,11 दोनों के संबंध में घाव भरने के परिणाम पर स्थानीय fibroblasts की आंतरिक गुणों बनाम पर्यावरण के सापेक्ष प्रभाव oncerning। त्वचीय डर्मिस और पहले भ्रूण (E15) बनाम मौखिक माउस के उपचार में महत्वपूर्ण मतभेद को देखते हुए बनाम बाद में भ्रूण (E18) डर्मिस, यह निश्चित विकासात्मक उम्र में और विभिन्न शारीरिक साइटों के बीच fibroblasts की आबादी में आंतरिक मतभेद मौजूद है कि संभावना है ।
1986 में, हेरोल्ड एफ ड्वोरक ट्यूमर 12 से ठीक नहीं है कि घाव हैं मंजूर किया। ड्वोरक ट्यूमर शरीर में घाव की तरह व्यवहार करते हैं और मेजबान की प्रतिक्रिया घाव भरने को सक्रिय करने से उनकी स्ट्रोमा प्रेरित कि संपन्न हुआ। कई अध्ययनों के बाद से कार्सिनोमा 13-15 की प्रगति के लिए fibroblasts की योगदान की जांच की है, लेकिन घाव भरने, पहचान और त्वचा संबंधी सीए की स्ट्रोमल डिब्बे में योगदान देने वाले fibroblasts की भ्रूण मूल के मामले मेंrcinomas पर्याप्त रूप से परिभाषित नहीं किया गया है। इस सवाल का जवाब विरोधी कैंसर चिकित्सा 16 के लिए एक संभावित प्रभावी लक्ष्य के रूप में ट्यूमर जुड़े fibroblast प्रकाश में लाने के हाल के अध्ययनों से दिए गए चिकित्सा प्रासंगिकता भालू।
पहचान करना और भावी विवो में fibrogenic क्षमता के साथ संपन्न fibroblast प्रजातियों को अलग-थलग प्रभावी रूप से तीव्र और जीर्ण रोग राज्यों की एक विस्तृत श्रृंखला में चोट के लिए उनकी प्रतिक्रिया में हेर-फेर करने की दिशा में एक आवश्यक कदम है। 1987 में, Cormack मस्सेदार और जालीदार डर्मिस 17,18 के भीतर एक के भीतर रहने वाले fibroblasts की दो उप-जनसंख्या, एक प्रदर्शन किया। एक तीसरा उप-जनसंख्या कूप 19,20 के त्वचीय papilla क्षेत्र में बालों के रोम के साथ जुड़े पाया गया था। जब सुसंस्कृत, विकास क्षमता, आकृति विज्ञान, और विकास के कारक / साइटोकिन्स में इन fibroblast उपप्रकार प्रदर्शनी मतभेद 21-24 प्रोफाइल।
तिथि करने के लिए, fibroblast की जांच के अध्ययन वहterogeneity काफी हद तक पर्याप्त रूप से इन विवो में fibroblasts के बीच विकास और कार्यात्मक विविधता को चिह्नित करने में नाकाम रहे हैं। इस भाग में, सुसंस्कृत fibroblast आबादी पर निर्भरता नहीं है और सभी fibroblasts 25 द्वारा व्यक्त की एक आत्म सतह रिसेप्टर के आधार पर सेल संस्कृति या सकारात्मक चयन के homogenizing प्रभाव का एक परिणाम है। हमारी प्रयोगशाला से एक ताजा अध्ययन में एक गहरा सतह मार्कर और इस पांडुलिपि 26 में प्रस्तुत FACS आधारित अलगाव कार्यप्रणाली से अलग बनाम सुसंस्कृत असभ्य fibroblasts में ट्रांसक्रिप्शनल पारी का प्रदर्शन किया।
बाद में, हम murine पृष्ठीय डर्मिस के भीतर एक विशिष्ट fibroblast वंश की पहचान और Engrailed -1 की भ्रूण अभिव्यक्ति द्वारा परिभाषित इस वंश, पृष्ठीय त्वचा में संयोजी ऊतक बयान के लिए मुख्य रूप से जिम्मेदार है कि निर्धारित। घाव भरने, कैंसर स्ट्रोमा गठन, और सहित फाइब्रोसिस की तीव्र और जीर्ण रूपों दोनों दौरान वंश कार्योंविकिरण फाइब्रोसिस 27 प्रेरित किया। अलग fibroblast प्रजातियों के लक्षण वर्णन fibrogenic व्यवहार नियमन करने के उद्देश्य से उपचार के लिए महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है।
बल्कि सेल अलगाव 28,29 प्राप्त करने के लिए इन विट्रो में गड़बड़ी पर भरोसा करते हैं कि मौजूदा प्रोटोकॉल का उपयोग करने से, यहाँ विस्तृत फसल प्रोटोकॉल (चित्रा 1) अधिक सही विवो में phenotype और व्यवहार पर कब्जा कि fibroblasts की उपज जानकारीपूर्ण विश्लेषण में मदद मिलेगी।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस पांडुलिपि में वर्णित प्रोटोकॉल एक उप-जनसंख्या के लिए चुन सकते हैं या बाद के विश्लेषण से पहले सेल संस्कृति में समय की आवश्यकता है, जो या तो मौजूदा तरीकों की तुलना में, FACS आधारित छँटाई द्वारा fibroblasts को अलग…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम (एचपीएल) के लिए एनआईएच अनुदान R01 GM087609, (MTL करने के लिए) (एचपीएल) के लिए एंथनी शू, एनआईएच अनुदान U01 HL099776 के सम्मान में इंग्रिड लाइ और बिल शू से एक उपहार है, Hagey प्रयोगशाला के लिए से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था बाल चिकित्सा पुनर्योजी चिकित्सा और ओक फाउंडेशन (MTL करने के लिए, GCG और एचपीएल)। GGW मेडिसिन के स्टैनफोर्ड स्कूल, स्टैनफोर्ड चिकित्सा वैज्ञानिक प्रशिक्षण कार्यक्रम के द्वारा समर्थित है, और NIGMS प्रशिक्षण अनुदान GM07365 था। ZNM प्लास्टिक सर्जरी फाउंडेशन रिसर्च फैलोशिप अनुदान और Hagey परिवार फंड द्वारा समर्थित किया गया। एमएसएच पुनर्योजी चिकित्सा के लिए कैलिफोर्निया इंस्टीट्यूट (सीआईआरएम) क्लीनिकल फैलो प्रशिक्षण अनुदान TG2-01159, मैक्सिलोफेशियल सर्जन के अमेरिकन सोसायटी (ASMS) / मैक्सिलोफेशियल सर्जन फाउंडेशन (एमएसएफ) अनुसंधान अनुदान पुरस्कार, और प्रत्यारोपण और ऊतक इंजीनियरिंग फैलोशिप पुरस्कार द्वारा समर्थित किया गया।
Materials
| Surgical Forceps | Kent Scientific | INS650916 | |
| Micro-scissors | Kent Scientific | INS600127 | |
| Povidone Iodine Prep Solution | Dynarex | 1415 | |
| Nair (depilatory cream) | Church and Dwight Co. | 22600267058 | |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | |
| Elastase | Abcam | ab95133 | |
| DMEM | Life Technologies | A14430-01 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000-044 | |
| Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) lysing buffer | Gibco | A10492-01 | |
| 40 micron filters | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| 70 micron filters | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| 100 micron filters | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| CD31 | BioLegend | 102421 | |
| CD45 | BioLegend | 103125 | |
| Tie2 | BioLegend | 124005 | |
| Ter-119 | BioLegend | 116233 | |
| EpCAM (CD326) | eBioscience | 48-5791 | |
| DAPI | Invitrogen | D3571 | |
| propidium iodide (PI viability stain) | BioLegend | 421301 |
Riferimenti
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