Isolamento de fibroblastos de murino Dérmica por FACS
Summary
Fibroblast behavior underlies a spectrum of clinical entities, but they remain poorly characterized, largely due to their inherent heterogeneity. Traditional fibroblast research relies upon in vitro manipulation, masking in vivo fibroblast behavior. We describe a FACS-based protocol for the isolation of mouse skin fibroblasts that does not require cell culture.
Abstract
Os fibroblastos são o tipo de célula princípio responsável pela secreção de matriz extracelular e são um componente essencial de muitos órgãos e tecidos. Fibroblastos fisiologia e patologia subjacente um espectro de entidades clínicas, incluindo fibroses em múltiplos órgãos, cicatrizes hipertróficas seguintes queimaduras, perda da função cardíaca após isquemia, e a formação de estroma cancro. No entanto, os fibroblastos continuam a ser um tipo de célula mal caracterizada, em grande parte devido à sua heterogeneidade inerente. Métodos para o isolamento de fibroblastos existentes requerem tempo em cultura de células que influencia profundamente o comportamento das células e fenótipo. Consequentemente, muitos estudos que investigam a biologia de fibroblastos confiar manipulação in vitro e não capturar com precisão o comportamento de fibroblastos in vivo. Para superar este problema, desenvolveu-se um protocolo baseado em FACS para o isolamento de fibroblastos a partir de pele dorsal de ratinhos adultos que não necessita de cultura de células, assim preserving a transcrição fisiológico e proteômica perfil de cada célula. Nossa estratégia permite a exclusão de linhagens não-mesenquimais através de um portão negativo linhagem (Lin -) em vez de uma estratégia de seleção positiva para evitar a pré-selecção ou enriquecimento de uma subpopulação de fibroblastos expressando marcadores de superfície específicos e ser o mais abrangente possível através deste heterogêneo tipo de célula.
Introduction
Os fibroblastos são frequentemente definidas morfologicamente como células fusiformes que aderem aos substratos de plástico. Os fibroblastos são o tipo de célula princípio responsável pela síntese e remodelação da matriz extracelular em embrionárias e adultas órgãos 1. Os fibroblastos são, portanto, essencial para o desenvolvimento dos mamíferos e contribuir substancialmente para o meio extracelular, que influencia o comportamento do vizinho tipos de células presentes em cada tecido e órgão.
Os fibroblastos são também o tipo de célula principal por trás de um conjunto diversificado de condições médicas que causam enorme fardo clínico. Actividade patológica de fibroblastos prejudica a função do tecido normal e inclui tecido e fibrose dos órgãos (tais como fígado e pulmão), a cicatrização a seguir a cicatrização cutânea da ferida, aterosclerose, esclerose sistémica, e a formação de placas de ateroma após a lesão do vaso sanguíneo 2-5. Cicatrização de feridas em particular, tanto de forma aguda e crônica, envolve deposition de tecido cicatricial que nem se assemelha nem funções como o tecido normal circundante ele, e leva a morbidade significativa em diversos estados patológicos. Após lesão, existe uma transição de fibroblastos para miofibroblastos, em seguida, que segregam os componentes da ECM estruturais, exercem efeitos parácrinos em tipos de células vizinhas, e restabelecer a estabilidade mecânica através do depósito de tecido cicatricial 6.
Em tecidos cutâneos existe variação significativa na qualidade de reparação de feridas através do tempo de desenvolvimento e entre os locais anatômicos. Nos dois primeiros trimestres de vida do feto cura sem cicatrizes; No entanto, a partir do terceiro trimestre e em toda a vida adulta, cura dos humanos com uma cicatriz. , Para além específica para a idade, cicatrização de feridas em diferenças existem específica do local. Feridas na cavidade oral remodelar com formação de cicatriz mínima 7,8, enquanto a deposição de tecido cicatricial dentro de feridas cutâneas é significativa 9. A controvérsia persiste concerning a influência relativa do ambiente contra as propriedades intrínsecas dos fibroblastos locais sobre os resultados da cicatrização de feridas em relação à idade e localização 10,11. Dadas as diferenças significativas na cicatrização de rato oral versus derme cutâneas e embrionário antes (E15) vs. depois embrionário (E18) derme, é provável que existem diferenças intrínsecas nas populações de fibroblastos em determinadas idades e de desenvolvimento entre os vários locais anatômicos .
Em 1986, Harold F. Dvorak postulou tumores são feridas que não cicatrizam 12. Dvorak concluir-se que os tumores se comportam como feridas no corpo e induzir a sua estroma através da activação da ferida resposta do hospedeiro de cura. Numerosos estudos têm investigado uma vez que a contribuição de fibroblastos para a progressão de carcinomas 13-15, mas, como no caso da cicatrização de feridas, a identidade e origem embrionária dos fibroblastos que contribuem para o compartimento estromal da CA cutânearcinomas não foi adequadamente definido. A resposta a esta questão não tem relevância médica dada estudos recentes expondo a fibroblastos associado ao tumor como um alvo potencialmente eficaz para a terapia anti-câncer 16.
Identificar e prospectivamente isolar linhagens de fibroblastos dotados de potencial fibrogenic in vivo é um passo essencial para efetivamente manipular sua resposta à lesão através de uma ampla gama de estados agudos e crônicos. Em 1987, Cormack demonstrou duas subpopulações de fibroblastos, uma residindo dentro de uma e a papilar na derme reticular 17,18. Uma terceira subpopulação foi encontrado associado com folículos pilosos na região papila dérmica do folículo 19,20. Quando cultivadas, essas diferenças subtipos de fibroblastos apresentam em potencial de crescimento, morfologia e crescimento / fator de citocinas perfis 21-24.
Até o momento, estudos examinando fibroblastos eleterogeneity pela maior parte não caracterizar adequadamente a diversidade de desenvolvimento e funcional entre fibroblastos in vivo. Isto é, em parte, é um resultado de uma dependência de populações fibroblastos cultivadas e o efeito de homogeneização de cultura de células ou selecção positiva sobre a base de um receptor da superfície da auto não expresso por todos os fibroblastos 25. Um estudo recente de nosso laboratório demonstraram um marcador de superfície profunda e mudança de transcrição em fibroblastos incultos cultivadas vs. isoladas pela metodologia de isolamento à base de FACS apresentada neste manuscrito 26.
Subsequentemente, foi identificada uma linhagem de fibroblastos específica no interior da derme dorsal de murino e determinaram que esta linhagem, definida pela expressão embrionária de Engrailed-1, é o principal responsável pela deposição de tecido conjuntivo na pele dorsal. As funções de linhagem durante ambas as formas aguda e crônica da fibrose incluindo a cicatrização de feridas, formação de estroma câncer, eradiação induzida fibrose 27. A caracterização de linhagens de fibroblastos distintas tem implicações críticas para terapias destinadas a modulação do comportamento fibrogenic.
Ao invés de usar protocolos existentes que se baseiam em manipulação in vitro, para obter o isolamento de células 28,29, o protocolo de colheita (Figura 1) descrito aqui vai ajudar análises informativos rendimento de fibroblastos que capturam mais precisamente fenótipo e o comportamento in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo descrito neste manuscrito oferece um meio para isolar fibroblastos pela triagem baseada em FACS, em comparação com os métodos existentes, o que quer para seleccionar uma subpopulação ou necessitam de tempo em cultura de células antes de análises subsequentes. O tempo necessário desde a colheita da pele para a triagem de fibroblastos é de cerca de 6 horas; No entanto, o número de ratos utilizados na colheita vai influenciar esta estimativa.
Vários pontos do protocolo re…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado em parte por uma concessão do NIH subvenção R01 GM087609 (para HPL), um presente de Ingrid Lai e Bill Shu em honra de Anthony Shu (para HPL), NIH concessão U01 HL099776 (para MTL), o Laboratório Hagey para Pediatric Regenerative Medicine e The Oak Foundation (para MTL, GCG e HPL). GGW foi apoiado pela Escola de Medicina de Stanford, o Programa de Formação de Stanford Medical Scientist, e bolsa de formação NIGMS GM07365. Znm foi apoiado pela Fundação de Pesquisa de Cirurgia Plástica Fellowship Grant eo Fundo Família Hagey. MSH foi apoiado pelo Instituto Califórnia de Medicina Regenerativa (CIRM) Fellow Clínica formação TG2-01159 concessão, a Sociedade Americana de Cirurgiões Maxilo (ASMS) / Cirurgiões Buco Maxilo Facial Foundation (MSF) Research Award Grant, e de Transplante e Engenharia de Tecidos Prémio Fellowship.
Materials
| Surgical Forceps | Kent Scientific | INS650916 | |
| Micro-scissors | Kent Scientific | INS600127 | |
| Povidone Iodine Prep Solution | Dynarex | 1415 | |
| Nair (depilatory cream) | Church and Dwight Co. | 22600267058 | |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | |
| Elastase | Abcam | ab95133 | |
| DMEM | Life Technologies | A14430-01 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000-044 | |
| Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) lysing buffer | Gibco | A10492-01 | |
| 40 micron filters | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| 70 micron filters | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| 100 micron filters | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| CD31 | BioLegend | 102421 | |
| CD45 | BioLegend | 103125 | |
| Tie2 | BioLegend | 124005 | |
| Ter-119 | BioLegend | 116233 | |
| EpCAM (CD326) | eBioscience | 48-5791 | |
| DAPI | Invitrogen | D3571 | |
| propidium iodide (PI viability stain) | BioLegend | 421301 |
Riferimenti
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