Viene descritto un metodo cromatografico in due fasi per la purificazione della proteina Shadoo ricombinante espressa come corpi di inclusione in Escherichia coli, nonché un protocollo per fibrillare Shadoo purificato in strutture amiloidi.
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Articolo metodologico
Purificazione e ripiegando a amiloide fibrille di (sua)
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il sistema di espressione coli Escherichia è uno strumento potente per la produzione di proteine eucariotiche ricombinanti. Lo usiamo per produrre Shadoo, una proteina appartenente alla famiglia prione. Un metodo cromatografico per la purificazione di (suo) 6 -tagged Shadoo ricombinante espressa come corpi di inclusione è descritto. I corpi di inclusione vengono solubilizzati in 8 M urea e legati ad un 2+ colonna -charged Ni eseguire cromatografia di affinità ionico. Proteine legate sono eluite da un gradiente di imidazolo. Le frazioni contenenti proteine Shadoo mediante cromatografia di esclusione dimensionale per ottenere una proteina altamente purificata. Nella fase finale è purificato Shadoo dissalati per eliminare i sali, urea e imidazolo. Proteina ricombinante Shadoo è un reagente importante per gli studi biofisici e biochimici di disturbi conformazione della proteina che si verificano nelle malattie da prioni. Molti rapporti hanno dimostrato che le malattie neurodegenerative da prioni provengono dalla deposizione di pugnalatale, ordinò fibrille amiloidi. Protocolli di esempio descrivono come alla fibrillazione Shadoo in fibrille amiloidi in acido e neutro / pHs di base sono presentati. I metodi su come produrre e fibrillazione Shadoo può facilitare la ricerca in laboratori che lavorano su malattie da prioni, in quanto consente per la produzione di grandi quantità di proteine in maniera rapida e basso costo.
Introduzione
Prion malattie neurodegenerative, tra cui l'encefalopatia spongiforme bovina nel bestiame, la scrapie ovina, malattia di Creutzfeldt-Jakob negli esseri umani, sono fatali e incurabile. Le malattie da prioni sono caratterizzate da cambiamenti conformazionali di proteina prionica cellulare principalmente composti da alfa-eliche, in cross-β-sheet arricchito amiloide conformer 1,2. Cross-beta-strutture contengono densamente imballati e beta-sheets cristallini come altamente ordinati stabilizzati con legami idrogeno 3,4. Amiloidi da prioni grado di autoreplicarsi causa delle beta-filoni sul bordo crescente che forniscono un modello per il recluta....
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Protocollo
1. Generazione di plasmidi e Shadoo Expression
Nota: Il gene che codifica la proteina murino Shadoo (Shadoo 25-122), è stato subclonato nel vettore di espressione pET-28 11. Questo clone è stata trasformata in E. coli SoluBL21 ceppo batterico, per esprimere la proteina Shadoo con un tag hexahistidine N-terminale, (HHHHHHHHHHSSGHIDDDDKHMKGGRGGARGSARGVRGGARGASRVRVRP APRYGSSLRVAAAGAAAGAAAGVAAGLATGSGWRRTSGPGELGLEDDENGAMGGNGTDRGVYSYWAWTSG), come spiegato in precedenza 11. Il plasmide può essere richiesto da parte degli autori. Il peso molecolare di Shadoo calcolata dalla sua sequenza aminoacidica è 12,24....
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Risultati
Circa 5-10 mg di proteine Shadoo purificato viene ottenuto per litro di coltura batterica. Una purificazione a due fasi è necessario per ottenere Shadoo ricombinante di elevata purezza. Il primo passo è effettuata mediante cromatografia di affinità con un Ni 2 + colonna -charged che conserva i suoi-proteine taggati. Frazioni eluite sono sottoposti a SDS-PAGE e colorazione con Coomassie Brilliant Blue (Figura 5A). Le frazioni contenenti proteine Shadoo sono raggruppati e ulteriormente pu.......
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Discussione
Un protocollo semplice ed efficace sia per l'espressione e la purificazione di una grande quantità di topo ricombinante proteina Shadoo è presentato. Il metodo descritto consente solubilizzazione successo e purificazione (His 6) -tagged proteina Shadoo ricombinante. È importante, come indicato nel titolo, che quando espresso in un batterio E. procariotico coli Shadoo accumula nei corpi di inclusione. Prima Shadoo purificazione, i batteri devono essere lisate per sonicazione in un tampone.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano Natalie Doude e David Westerway (Università di Alberta) per averci fornito Sho cDNA, Christophe Chevalier (INRA) per la costruzione dei plasmidi, Michel Brémont (INRA) per averci fornito i batteri BL21Sol; Christine Longin (INRA) per l'assistenza GST e Edith Pajot-Augy (INRA) per i commenti e la correzione di bozze.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| AKTA FPLC | GE, Amersham | # 1363 | |
| HiLoad 16/60 Superdex | GE Healthcare | 17-1069-01 | |
| HiTrap IMAC | GE Healthcare | GE17-0920-05 | |
| HiPrep26/10 Colonna di desalinizzazione | GE Healthcare | GE17-5087-01 | |
| SoluBL21 Competente E. coli | Genlantis | C700200 | |
| pET-28b+ | Novogen | 69865-3 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| LB-Brodo medio | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Eppendorf Biofotometar | Eppendorf | 550507804 | |
| Trito X-100 | Life Technologies | 85111 | |
| NiSO4 | Sigma-Aldrich | 656895 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich RES3098T | ||
| Compresse di Cocktail di Inibitori della Proteasi | Roche | 4693116001 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 746398 | |
| Imidazol | Sigma-Aldrich | I5513 | |
| Gdn-HCl | Sigma-Aldrich | G4505 | |
| marcatore di dimensione della proteina | Thermo Fisher Scientifico | 26620 |
Riferimenti
- Biasini, E., Turnbaugh, J. A., Unterberger, U., Harris, D. A. Prion protein at the crossroads of physiology and disease. Trends in Neurosciences. 35, 92-103 (2012).
- Colby, D. W., Prusiner, S. B. De novo generation of prion strains. Nature Reviews. Microbiology. 9, 771....
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Ristampe e permessi
