Air-abgetastete Filteranalyse für Endotoxine und DNA-Gehalt
Summary
Two complementary analyses of atmospheric biological particles from air sampled filters are described herein: the extraction and detection of endotoxin, and of DNA.
Abstract
Außenaerosolforschung verwendet allgemein Partikel auf Filter abgetastet. Dieses Verfahren ermöglicht es, verschiedene Charakterisierungen der gesammelten Partikel in parallel durchgeführt werden. Der Zweck der hier vorgestellten Verfahren ist es, eine hochgenaue und zuverlässige Analyse des Endotoxin und DNA-Gehalt von Bio-Aerosole aus den Filtern extrahiert zu erhalten. Die Gewinnung von hochmolekularen organischen Moleküle, wie Lipopolysacchariden, aus abgetasteten Filter beinhaltet Schütteln der Probe in einer pyrogenfreien Medium auf Wasserbasis. Die nachfolgende Analyse basiert auf einer Enzymreaktion basiert, die unter Verwendung einer turbidimetrischen Messung erfasst werden können. Als Ergebnis des hohen organischen Anteils auf den abgetasteten Filter wird die Extraktion der DNA aus den Proben durchgeführt, eine kommerzielle DNA-Extraktions-Kits verwenden, die ursprünglich für Böden entworfen und modifiziert, um die DNA-Ausbeute verbessern. Der Nachweis und die Quantifizierung von spezifischen mikrobiellen Spezies unter Verwendung quantitative polymerase chain Reactiauf (q-PCR) Analyse mit anderen verfügbaren Methoden beschrieben und verglichen.
Introduction
Air Probenahme auf Filter ist ein grundlegendes Instrument in atmosphärischen Aerosolen Forschung. 1 Die abgetasteten Filter der Ausgangspunkt für verschiedene chemische, physikalische und biologische Charakterisierungen der gesammelten Umgebungspartikel sind. 11.02 Der Vorteil dieses Ansatzes besteht darin , dass verschiedene Analysen sein kann off-line auf der gleichen Probe durchgeführt. Kompilieren der Daten aus den verschiedenen Analysen der Forscher ermöglicht bei der Lösung komplexer Fragestellungen in den atmosphärischen Wissenschaften ein gutes Verständnis für die Eigenschaften der gesammelten Partikel und Hilfsmittel zu erhalten. 12,13 Zum Beispiel Meeres- und Binnenluftproben , die während der gleichen genommen Zeitraum kann in Bezug auf das abgetastete Partikel Toxizität und biologische Zusammensetzung verglichen. 14 Für diese Studie Lipopolysaccharide (LPS), Komponenten auf gram-negativen Bakterienzellwände, auch als Endotoxine bekannt sind , wurden von den Filtern on-shore abgetastete extrahiert und ein Binnenstelle und wurden unter Verwendung bewertet dieLimulusamöbocytenlysat (LAL-Test). Verwendung der quantitative Polymerase-Kettenreaktion (q-PCR) parallel wird eine genomische Auswertung des Bakteriengehalt (total Bakterien, gramnegative und Cyanobakterien) wurde an derselben Probe durchgeführt. Der LAL – Test basiert auf der Messung der Trübung nach der Zugabe eines wässrigen Extrakts aus Amöbozyten von dem Pfeilschwanzkrebs Limulus polyphemus gebildet, zu einer wässrigen Lösung , die Endotoxine enthält. Je höher die Endotoxin – Konzentration in der Probe entwickelt die schneller Trübung. 15 die q-PCR – Analyse auf einem Fluoreszenzsignal basiert , als ein spezifisches DNA – Fragment emittiert wird verstärkt. 16 durch Echtzeit – Überwachung des Signals während der exponentiellen Phase der PCR Reaktion und Kalibrierung mit einer Standardkurve, die anfängliche DNA-Menge quantifiziert werden kann. Die Kombination dieser beiden Analysen zusammen mit anderen, wie anderswo detailliert, 14 eine gute Schätzung des Gehalts an Endotoxin liefern kann und dasMenge der Quell Bakterien in den Proben.
Der Zweck der hier vorgestellten Verfahren ist es, eine hochgenaue und zuverlässige Analyse des Endotoxin und DNA-Gehalt von Bio-Aerosole aus den Filtern extrahiert zu erhalten. Während Verfahren die physikalischen und anorganischen chemischen Eigenschaften von Aerosolen zur Abtastung bekannt sind und in jüngster Zeit sind Verfahren entwickelt worden , dessen organischer Substanz Komponente zu untersuchen, 17 dort hat auf die biologische Komponente von Aerosolen wenig Forschung. 18 Der Grund für die aktuelle Methode ist , diese Lücke zu schließen, indem zum Extrahieren im Detail ein robustes Verfahren präsentiert, die Analyse und die biologische Fraktion in der Luft Aerosole zu identifizieren. 14
Die Methode , die hier detailliert wird erwartet , dass weit verbreitete Verwendung in der biologischen Innen- und Außenaerosolforschungsprojekte mit Filteranalyse zu finden. 20-24
Protocol
Representative Results
Discussion
Diese Arbeit beschreibt Extraktion und Nachweismethoden für beide Endotoxinen und DNA, die in Aerosolproben auf Filtern gesammelt zu quantifizieren. Die Methoden erfordern eine genaue Routinen und kann leicht so lange durchgeführt werden, wie der Experimentator auf wenige wesentliche und wichtige Punkte hält sich hier diskutiert.
Für die Endotoxin-Nachweisschritt zu beachten, dass das Lysat Lösung ziemlich viskos und neigt dazu, Blasen beim Pipettieren zu erzeugen. Es ist schwierig, dic…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Dr. Yoav Barak from the Chemistry Faculty, Weizmann Institute, for support and advice. This study was supported by the Israel Science Foundation (grant # 913/12), and by the Minerva Foundation with funding from the Federal German Ministry for Education and Research.
Materials
| Filter sampling | |||
| HiVol 3000 – High Air Volume Sampler | Ecotech | ||
| Quartz Microfiber Filters | Whatman | 1851-865 | 203mm X 254mm |
| ELF – Laboratory Chamber Furnaces | Carbolite | ELF 11series | |
| Aluminum foil | Opal | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Endotoxin | |||
| Ethanol | Sigma Aldrich | 16368 | Laboratory Reagent, 96% |
| Airstream Class II Biological Safety Cabinet AC-4E1 | ESCO | 10011712 | |
| Pyrotell -T | Associates of Cape Cod, Inc. | T0051 | |
| Control Standard Endotoxin | Associates of Cape Cod, Inc. | E0005-1 | Escherichia coli O113:H10, 0.5 µg/vial 1 Pack |
| LAL Reagent Water | Associates of Cape Cod, Inc. | W0051 | |
| 10 mL sterile syringe with Luer-Lok Tip | Becton-Dickinson & Co. | 309605 | |
| BD Precisionglide syringe needle | Becton-Dickinson & Co. | 305129 | Sterile |
| Parafilm-M sealing tape | Parafilm | P7543 | Sigma catalog number |
| Microtubes | Axigen | MCT-200-C | 2ml, pyrogen free |
| 1.12 cm diameter Cork Borer | Boekel Scientific | 1601 BD Series – Steel | Part of a cork borer set containing borers with various diameters. |
| 50 mm Petri Dish | Miniplast Ein-Shemer | 72050-01 | Aseptic |
| Vortex Genie 2 | Scientific Industries, inc. | SI-0297 | |
| Microcentrifuge 5415 D | Eppendorf | 22621408 | |
| TC MicroWell 96 F SI w/lid | Nunc | 167008 | Flat bottom wells (with lid (individually wrapped)), sterile, pyrogen free |
| Synergy HT Multi-Detection Microplate Reader | Biotek | 7091000 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNA | |||
| DNA away | Sigma Aldrich | 7010 | |
| Standard DNA of the microbial species of interest | ATCC or other culture collection | Either the appropriate microbial strain for DNA extraction or the extracted DNA | |
| Neubauer-improved | Marienfeld | 640030 | hemocytometer |
| TE buffer, Low EDTA | Life Technologies | 12090-015 | 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) 0.1 mM EDTA |
| Nuclease-free PCR-grade water | Sigma Aldrich | 3315959001 | |
| PCR primers | Sigma Aldrich | Targets the microbial species of interest | |
| Dual-Labeled Probes | Sigma Aldrich | Targets the microbial species of interest | |
| Screw cap tubes | Axigen | ST-200-SS | 2 mL |
| PowerSoil DNA extraction kit | Mo Bio Laboratories | 12888-100 | |
| Glass beads, acid-washed 425-600 Microns | Sigma Aldrich | G8772-100G | |
| Glass beads, acid-washed <106 microns | Sigma Aldrich | G4649-100G | |
| PowerSoil Solution C1 | Mo Bio Laboratories | 12888-100-1 | Cell lysis buffer , Power soil Kit |
| Magic Touch ice bucket | Bel-Art | 18848-4001 | |
| Mini-Beadbeater-16 | BioSpec | 607EUR | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4376600 | |
| Fast SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | 4385612 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystems | 4370048 | |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 mL | Applied Biosystems | 4346906 | |
| MicroAmp Splash-Free 96-Well Base | Applied Biosystems | 4312063 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems | 4311971 | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 5811 000.010 | Rotor A-4-62 with MTP buckets |
Riferimenti
- Lodge, J. P. J. . Methods of Air Sampling and Analysis. , (1988).
- Costa, V., et al. Characteristics of carbonaceous aerosols in Emilia-Romagna (Northern Italy) based on two fall/winter field campaigns. Atmos. Res. , (2015).
- Brent, L. C. . Development, enhancement, and evaluation of aircraft measurement techniques for national ambient air quality standard criteria pollutants [dissertation]. , (2014).
- Okuda, T., Schauer, J. J., Shafer, M. M. Improved methods for elemental analysis of atmospheric aerosols for evaluating human health impacts of aerosols in East Asia. Atmos. Environ. 97, 552-555 (2014).
- Hospodsky, D., et al. Characterizing airborne fungal and bacterial concentrations and emission rates in six occupied children’s classrooms. Indoor air. , (2014).
- Bottos, E., Woo, A., Zawar-Reza, P., Pointing, S., Cary, S. Airborne Bacterial Populations Above Desert Soils of the McMurdo Dry Valleys, Antarctica. Microb. Ecol. 67, 120-128 (2014).
- Ovadnevaite, J., et al. Submicron NE Atlantic marine aerosol chemical composition and abundance: Seasonal trends and air mass categorization. J. Geophys. Res. Atmos. 119, (2014).
- Lodge, J. ES&T Books: Methods of Air Sampling and Analysis, 3rd ed. Environ. Sci. Technol. 23, 938 (1989).
- Pramod, K., Baron, P. A., Willeke, K. . Aerosol Measurement: Principles, Techniques, and Applications. , (2011).
- Vincent, J. H. . Aerosol Sampling: Science, Standards, Instrumentation and Applications. , (2007).
- Duquenne, P., Marchand, G., Duchaine, C. Measurement of Endotoxins in Bioaerosols at Workplace: A Critical Review of Literature and a Standardization Issue. Ann. Occup. Hyg. 57, 137-172 (2013).
- Okuda, T., Schauer, J. J., Shafer, M. M. Improved methods for elemental analysis of atmospheric aerosols for evaluating human health impacts of aerosols in East Asia. Atmos. Environ. 97, 552-555 (2014).
- Lewtas, J. Air pollution combustion emissions: Characterization of causative agents and mechanisms associated with cancer, reproductive, and cardiovascular effects. Mutat. Res.-Rev. Mutat. 636, 95-133 (2007).
- Lang-Yona, N., Lehahn, Y., Herut, B., Burshtein, N., Rudich, Y. Marine aerosol as a possible source for endotoxins in coastal areas. Sci. Total. Environ. 499, 311-318 (2014).
- Levin, J., Bang, F. B. Clottable protein in Limulus: its localization and kinetics of its coagulation by endotoxin. Thromb. Diath. Haemorrh. 19, 186-197 (1968).
- Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. Real time quantitative PCR. Genome Res. 6, 986-994 (1996).
- O’Dowd, C. D., de Leeuw, G. Marine aerosol production: a review of the current knowledge. Phil. Trans. R. Soc. A. 365, 1753-1774 (2007).
- O’Dowd, C. D., et al. Biogenically driven organic contribution to marine aerosol. Nature. 431, 676-680 (2004).
- Yang, R., Paparini, A., Monis, P., Ryan, U. Comparison of next-generation droplet digital PCR (ddPCR) with quantitative PCR (qPCR) for enumeration of Cryptosporidium oocysts in faecal samples. Int. J. Parasitol. 44, 1105-1113 (2014).
- Stetzenbach, L. D., Buttner, M. P., Cruz, P. Detection and enumeration of airborne biocontaminants. Curr. Opin. Biotechnol. 15, 170-174 (2004).
- Dannemiller, K. C., Gent, J. F., Leaderer, B. P., Peccia, J. Influence of housing characteristics on bacterial and fungal communities in homes of asthmatic children. Indoor air. , (2015).
- Yamamoto, N., Hospodsky, D., Dannemiller, K. C., Nazaroff, W. W., Peccia, J. Indoor emissions as a primary source of airborne allergenic fungal particles in classrooms. Environ. Sci. Technol. 49, 5098-5106 (2015).
- Yamamoto, N., et al. Particle-size distributions and seasonal diversity of allergenic and pathogenic fungi in outdoor air. ISME J. 6, 1801-1811 (2012).
- Karottki, D. G., et al. Cardiovascular and lung function in relation to outdoor and indoor exposure to fine and ultrafine particulate matter in middle-aged subjects. Environ Int. 73, 372-381 (2014).
- Guy, D., Hodges, N., Hanlon, G. Endotoxins and Depyrogenation. Industrial Pharmaceutical Microbiology: Standards and Controls. , 12.1-12.15 (2003).
- Thorne, P. S., Bartlett, K. H., Phipps, J., Kulhankova, K. Evaluation of Five Extraction Protocols for Quantification of Endotoxin in Metalworking Fluid Aerosol. Ann. Occup. Hyg. 47, 31-36 (2003).
- Thornton, B., Basu, C. Real-time PCR (qPCR) primer design using free online software. Biochem. Mol. Biol. Educ. 39, 145-154 (2011).
- Madigan, M. T., Clark, D. P., Stahl, D., Martinko, J. M. . Brock Biology of Microorganisms. , (2011).
- Watson, J. G., Chow, J. C. . Aerosol Measurement: Principles and Techniques. , 591-613 (2011).
- Mueller-Anneling, L., Avol, E., Peters, J. M., Thorne, P. S. Ambient endotoxin concentrations in PM10 from Southern California. Environ. Health Perspect. 112, 583-588 (2004).
- Hospodsky, D., Yamamoto, N., Peccia, J. Accuracy, Precision, and Method Detection Limits of Quantitative PCR for Airborne Bacteria and Fungi. Appl. Environ. Microbiol. 76, 7004-7012 (2010).
- Kutyavin, I. V., et al. 3′-Minor groove binder-DNA probes increase sequence specificity at PCR extension temperatures. Nucleic Acids Res. 28, 655-661 (2000).
- Brankatschk, R., Bodenhausen, N., Zeyer, J., Bürgmann, H. Simple absolute quantification method correcting for quantitative PCR efficiency variations for microbial community samples. Appl. Environ. Microbiol. 78, 4481-4489 (2012).
- Strober, W. Appendix 3B, Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology. , (2001).
- Hollander, A., Heederik, D., Versloot, P., Douwes, J. Inhibition and enhancement in the analysis of airborne endotoxin levels in various occupational environments. Am Ind Hyg Assoc J. 54, 647-653 (1993).
- Kennedy, S. . PCR troubleshooting and optimization : the essential guide. , (2011).
- Joiner, T. J., Kraus, P. F., Kupiec, T. C. Comparison of Endotoxin Testing Methods for Pharmaceutical Products. Int J Pharm Compd. 6, 408-409 (2002).
- Ebentier, D. L., et al. Evaluation of the repeatability and reproducibility of a suite of qPCR-based microbial source tracking methods. Water Res. 47, 6839-6848 (2013).
