병렬 세그먼트 흐름 열 조정과 멀티 플렉스 감지 활성화
Summary
Here, we present a protocol for the operation and tuning of parallel segmented flow chromatography columns to enable multiplexed detection.
Abstract
Active flow technology (AFT) is new form of column technology that was designed to overcome flow heterogeneity to increase separation performance in terms of efficiency and sensitivity and to enable multiplexed detection. This form of AFT uses a parallel segmented flow (PSF) column. A PSF column outlet end-fitting consists of 2 or 4 ports, which can be multiplexed to connect up to 4 detectors. The PSF column not only allows a platform for multiplexed detection but also the combination of both destructive and non-destructive detectors, without additional dead volume tubing, simultaneously. The amount of flow through each port can also be adjusted through pressure management to suit the requirements of a specific detector(s). To achieve multiplexed detection using a PSF column there are a number of parameters which can be controlled to ensure optimal separation performance and quality of results; that is tube dimensions for each port, choice of port for each type of detector and flow adjustment. This protocol is intended to show how to use and tune a PSF column functioning in a multiplexed mode of detection.
Introduction
활동 흐름 기술 열
활성 플로우 기술 (AFT) 크로마토 그래피 컬럼은 최근 흐름 이질성 1-6과 관련된 분리의 비 효율성을 극복하기 위해 개발되었고, 또한 다중 검출을 가능하게 할 수 있습니다. 이 특정 통신 우리의 세부 사항에 병렬의 작동 과정은 다중 검출과 흐름 (PSF) 열을 분할. PSF 열의 키 기능적 장점은 : (1) 칼럼 베드의 방사상 중심 영역으로부터의 흐름은, (2) 검출 수단에 의해 처리되어야하는 이동상의 부피 유량의 주연 또는 벽 영역으로부터 격리 소스가 감소되고, (3) 검색 소스 각각 검출 프로세스를 통해 검출 지연을 주입하거나,이어서 포스트 칼럼 유동 스트림 7,8의 분할을 필요로하지 않고 샘플 정보를 확장 다중화 될 수있다. 수 PSF 칼럼의 디자인의 핵심 기능다중 검출 dvantage은 새로운 출구 피팅 및 프릿 조립입니다. (1) 기존의 컬럼에 비해 AFT 컬럼의 사진도. 이 분할 프로세스는 포스트 칼럼 유동 스트림 분할과 동일하지 병렬 분할 흐름 컬럼을 사용하여 얻어지는 것을 이해하는 것이 중요하다. 포스트 칼럼 흐름 스트림 (즉, 축 방향으로), 이에 따라, 각각의 흐름 스트림이 효율 및 민감도에 대한 동일 균등 샘플링 꼬리의 말단에 전연으로부터 샘플 전체 대역을 분할; 감도의 크기함으로써 분할 수에 의해 분할된다. PSF 그러나, 분할 프로세스 샘플 밴드 반경 방향, 축 방향하지. 이와 같이, 중앙 포트 샘플 피크 정점 – 피크의 가장 농축 영역. 피크가 확산 미행 지역에 따라 희석되지 않기 때문에, 여기에 감도는 최고입니다. 주변 포트에서 용출 샘플은 CENTRA에서만큼 효율적이지 않다밴드가 다소 축 방향으로보다 반경 샘플링되기 때문에 L 존하지만, 피크의 폭, 즉 축 방향으로 포스트 칼럼 분할 피크 분할 샘플링 프로세스의 경우보다 좁다. 따라서 농도 의존적 검출기 감도가 감소되지 않습니다.
PSF 열에서 출구 피팅 다중 출력 포트를 포함하고, 피팅이 단부의 내측에 환형 프릿이 수납된다. 출구 프릿 채널의 바깥 지름 부는 상기 주변 또는 벽 영역 출구 흐름 포트를 통해 칼럼 유출하면서이 환형 프릿 채널의 내부 부분은, 반경 방향 중심 유출구를 통해 칼럼 유출. 출구 프릿의 내측 및 외측 부분은이 흐름 영역 (2) 사이의 교차 흐름을 방지하는 불 투과성 배리어에 의해 분리된다. 이러한 설계의 결과로 칼럼 베드를 통해 중앙 방사상 유동 스트림 벽 영역 인 흐름으로부터 분리열을 IDE. 이들 두 영역에서의 흐름의 상대적인 부분은 분리 효율이나 검출 감도와 같은 열 기술의 다양한 기능적 측면을 최적화하기 위해 압력 관리를 통해 거의 모든 원하는 비율로 변할 수있다. 본질적으로, 이러한 설계는 효과적으로 더 좁은 내부 지름을 갖는, 큰 포맷 칼럼 '가상'항목에서 설정 한 칼럼 베드 이질성과 벽 효과 9,10 극복 진정한 벽없는 열과 그에 열 함수.
PSF 컬럼의 주요 이점은 열 효율, 감지 소스 (S) 및 멀티 플렉스 검출을 가능하게하기위한 용매의 최소화 처리의 개선이다. 그러나, 추가적인 이점이 어떤 대역의 테일링 및 향하고있는 영역이 전체적으로 용출로부터 제거되기 때문에 용출 또는 검출에 용질을 프로파일 있다는 것은 달리 동일한 S 관찰되는 것보다 높은 농도로 존재채용 분할 비율에 따라, 종래의 칼럼에 주입하고 집중 하중 olute. 결과적으로 자주 PSF 컬럼 2 실시 분리 용 신호 강도의 증가가 관찰된다. 사실, 분할 비율은 네 개의 출력 포트 각각으로부터 흐름 종료 중 25 %, 자외선 (UV) 검출을 통해 관찰 된 신호 강도가 종래을 사용하여 알 수있는 바와 같이 동일한 신호 강도가 거의 보여 지도록 조정하면 이동상의 전체 (100 %) 7 열 분석된다. 또한, 중앙 및 벽 유동 출구 영역 사이의 비 미세 조정은 열 효율이 최적화 될 수있다. (1) 유량 (2) 분할 비, 및 (3) 용질 고정 계수 : 열 효율의 향상이 이러한 효율성 향상은 세 가지 요인의 함수이기 때문에, 하나의 값을 명시 할 수 없다 AFT 컬럼을 사용하여 관찰 . 그럼에도 불구하고, 효율 이익은 전환 수에 비해entional 열은 거의 항상 관찰하고, 이러한 이득은 때때로 이론적 플레이트 1,2- 수의 100 % 이상이다. 튜닝 기능은 분할 비율은 분석 효과적으로 '가상'칼럼의 직경을 조정할 수 있으며, 이는 검출 처리와 관련하여 중요한 인자이다. 분할 비율은 방사상 중앙 출구 포트로부터 용출 이동상 21 % 인 경우, 예를 들면, 가상 2.1 mm의 내부 직경 (ID) 열은 실제 4.6 mm ID 열에서 확립된다. 이러한 조건 하에서, 가상 2.1 mm ID 열은 유량에 따라, 종래의 2.1 mm ID 열보다 70 % 이상 더 클 수있다 효율성 및 용질 고정 인자 10 행한다.
멀티 플렉스 검출을 위해 사용되는 전류 PSF 컬럼 디자인은 4 포트는 출구 피팅 포함하지만, 열이 장착 될 수있는 2 포트는 최종 피팅 또한, 그러나,이 검출 t 제한두 검출기 오. 그 네 검출기 다중화 검출 범위를 넓히는 4 포트 출구 PSF 컬럼에 동시에 연결될 수를 제외하고이 열의 기본 동작은, 그러나, 동일하다. 이외에도 전후 열의 결합 튜브에서 유일한 추가적인 요구 PSF 열을 주변 출구 포트에 접속 될 수있는 튜빙, 각 튜브를 통과하는 이동상의 양을 측정 할 수있는 수단이되는 동작하도록, 일반적으로 질량 측정 또는 체적 측정 중. 튜닝을 용이하게하기 위해서, 모든 출구 유동 튜브의 내경은 동일해야한다. 둘레 방향 및 반경 방향 중앙 배출 포트 사이의 유동 비율은 단순히 끼워 주연 출구 또는 방사상 중앙 배출구에 호스 포스트 검출기의 길이에있는 튜브의 길이를 변화시킴으로써, 압력 관리의 사용을 통해 변경된다.
멀티 플렉스 감지 PSF 열을 사용하여 </stroNG>
PSF 열의 중요한 장점은 출구 배출 포트들의 각각은 다중화 따라서 검출을 가능하게하는 검출 소스에 직접 접속 될 수 있다는 것이다. 잘 설계된 검출 시스템에 다중화 검출 단일 분석 시료 내의 요소의 특성에 관해서 상당한 정보를 제공 할 수있다. 중요한 파괴 및 비파괴 시험 검출 지연없이 정확히 동시에 수행 될 수있다. 이것은 구성 요소가 UV 및 / 또는 질량 분광법 (MS) 검출로 응답 7,11 용출 관찰하여, DPPH • 시약을 사용하여 실시 예, 산화 방지제를 들면, 절대 할당을 허용한다. 따라서, 네 개의 독립 탐지기 네 출구 포트 중 통해 각 검출기에 관한 흐름의 적절한 부분들과 동시에 동작 할 수있다. 이들 포트를 통과하는 유동이 용이 검출기에 도달하는 모든 용질의 양을 조절할 수 있기 때문에 적합하도록 조절 될 수있다주어진 소스 검출기의 감도. 그것은 가장 효율적인 용질 이주 방사상 중앙 출구 포트를 통해 관측되는 점에 유의해야한다. 주변 각 포트에는 각 포트를 통해 25 %로 설정하면, 약간 덜 효율적인 기존의 열보다 동등한 분리 효율을 제공합니다. 이와 같이, 이것은 정량적 검출기 방사상 중앙 출구 포트에서 샘플을 분석하도록 설정하는 것이 중요하다.
다중화 검출 목적 PSF 열을 설정할 때 효율적이고 높은 품질의 결과를 달성하기 위해 만들어 질 필요 사항들이있다; 즉, 각 포트에 대한 튜브의 크기이며, 선택 검출기 및 유량 조정의 유형에있는 포트.
각 포트에 대한 튜브 치수
크로마토 그래피 후 컬럼 튜브의 길이가 분리 효율과 성능에서 중요한 역할을한다. 대형 마약 단속반검출기 열 콘센트에서 길거나 넓은 ID 튜브의 결과로 D-볼륨은 효율성, 해상도와 감도의 손실이 발생할 것입니다. 다중화의 이점을 제공하는 반면 효과적인 분리를 제공하는 최대 전위를 달성하기 PSF 열을 설정할 때, 따라서, 적절한 배관 사이즈가 이용되어야한다.
감지기 포트
그림 2는 다중 검출 (자외선 – 가시 (U-비스), 질량 분석기 (MS)와 2,2- 디 페닐 -1- 피 크릴 (DPPH •) 검출)의 예를 들어 설정의 그림입니다. 그림 중앙 포트 DPPH • 반면, MS 검출기에 부착되고 UV-비스 검출기 주변 포트에 연결되어 도시한다. MS는 세 가지의 가장 민감한 검출기 때문에, 중앙 배출구로부터 지시되었다이 검출기에 흐른다. DPPH • 감지으로 presenc에 선택적입니다산화 방지제의 전자,이 검출기에 흐름, 가장 민감하고 밴드 폭이 넓어에 가장 관대은 주변 포트에서 지시되었다. UV-비스 2 차 '일반'검출기, 그래서 제 주변 포트에서 지시 된이 검출기에 흐른다.
흐름 조정
튜브가 적절한 검출기 포트로부터 연결되면, 각각의 검출기로부터 나오는 흐름은 필요한 양으로 조정할 수있다. 각 검출기로부터 나오는 흐름의 양을 측정하는 간단한 방법은 주어진 기간에 걸쳐 각각의 포트를 통해 용출 이동상의 양을 계량한다. 백분율 흐름에 따라서 결정될 수 있으며, 유동 비율은 단축 또는 적절히 선택 검출기 요구 사항에 맞도록 검출기에 출구 라인에 연결된 호스를 길게하거나 조정할 수있다. 다른 탐지기의 예를 들면, 플로우 셀, 유동의 다양한 요구를 가지고형광 검출기 (FLD)는 유동 속도가 제한되지 않으며, 치료는 플로우 셀의 과압을 방지하기 위해주의해야한다. 따라서 FLD를 통해 흐름의 제어는 일반적으로 다른 검출기에 걸쳐 압력 강하 및 유량의 나머지 다음 FLD 통과를 조정함으로써 달성된다. 전달되는 유동의 양에 민감한 검출기 MS이다. 일반적으로, 현재의 하이 엔드 질량 분석기 용이 약 1~1.5 ㎖ / 적당히 수성 이동상 분을 처리 할 수있다. 이 유량 위, 소스의 홍수는 MS가 작동 할 수 있습니다. 그러나, 대부분의 질량 분석기에서 검출 감도가 낮은 흐름 속도를 사용하여 이득되고; 따라서 PSF 흐름 분할 기능은 MS 검출과 관련된 애플리케이션에 매우 유용하다. 높은 열 체적 유량하지만 MS 검출기로 운반 저용량 부하와 함께, 이용 될 수있다. MS 검출기의 조정 흐름은, 그러나, 이전의 압력 강하를 조절함으로써 이루어질 수 있어야MS 검출기보다는 포스트 MS. 압력이 용이 부적절한 데드 볼륨을 추가하지 않고 조정될 수있다 여기 좁은 보어 튜빙 (0.1 mm의 ID)의 사용은 매우 유용하다.
검출기의 유형에 분할 비의 조정을 따라 전 또는 후 어느 검출기를 수행 할 수있다. 이러한 UV-비스를 사용하는 등의 비파괴 검출기는, 유동 비율을 측정 한 후 검출기를 조정하면된다. 단일 검출기 파괴가 설정된 다중화에 사용되는 경우 유동 비율은 다시 다른 포트 유동 비율에 대해 계산함으로써 결정된다. 시약 기반 검출기는 DPPH •로 사용되는 경우, 유동 비율은 시약의 첨가없이 포스트 검출기를 측정한다; 둘 이상의 파괴 검출기가 사용된다면, 그때 유량비 미리 검출기 측정된다. 인식 추가 계측, 이러한 DPPH • 필요할 수 있습니다 시스템, 흐름을 바꿀 수 있습니다 여분의 시스템 압력이있을 것이다백분율 일단 검출 시스템에 부착. 따라서,주의 깊은 고려가 파괴 검출기의 시스템 압력, 유량 비율을 조정 사전 검출기에 지불해야한다. 상관없이 임의의 포트를 통해 설정된 유량의 비율의 정량 정보는 적절한 표준화 통해 얻어 져야한다. 유량비가 설정되면, 그러나, 그들이 견고하고, 심지어 그들이 구배 용출 조건하에 7 변경하지 않는,
이 원고를 동반 상세한 비디오 프로토콜은 검출 다중화 모드에서 PSF 열 기능을 사용하고 조정하는 방법을 보여하기위한 것입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 연구는 특성화 및 다중 검출 병렬 분할 흐름 (PSF) 컬럼을 사용하여 HPLC를 사용하여 커피의 프로파일을 포함한다. PSF 열을 다중화 HPLC는 종래의 다중 검출 프로세스를 사용하여 소요 시간의 분획 내에 분자 특정 정보의 큰 정도를 획득하는 동안 샘플의 데이터의 복잡도를 감소시킴으로써 키 화학적 실체의 특성화 및 식별을 가능하게한다. PSF 열은 멀티 플렉스 검출을위한 플랫폼을 허용하지만, ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by UWS and ThermoFisher Scientific. One of the authors (DK) acknowledges the receipt of an Australian Postgraduate Award.
Materials
| HPLC instrument | Multiple detectors of choice for multiplexed detection. Detectors of choice may require additional instrumentation i.e. pump. | ||
| Parallel Segmented Flow HPLC column | Thermo Fisher Scientific | Not Defined | Soon to be commercialised |
| Methanol | Any brand | HPLC Grade | |
| PEEK tubing | Any brand | Various lengths and i.d. | |
| Column stoppers | Any brand | For blocking unused peripheral ports. | |
| PEEK tube cutter | Any brand | ||
| Analytical Scale Balance | Any brand | ||
| Stop watch | Any brand | ||
| Eluent collection vessels | Any brand | 1-2 mL Sample vials can be used as eluent collection vessels |
Riferimenti
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