Компьютерная томография и оптическая томография остеогенеза ангиогенеза муфта для оценки интеграция кости черепа аутотрансплантатов и аллотрансплантатов
Summary
Имплантация аутологичных и аллогенных трансплантатов костного представляют собой приняты подходы для лечения черепно-лицевой главную потерю костной массы. Тем не менее, эффект трансплантата состава на взаимодействии между неоваскуляризации, дифференциации клеток и формирования костной ткани остается неясным. Мы представляем мультимодального протокол изображения, направленный на выяснение ангиогенеза остеогенез взаимозависимость в привитой близости.
Abstract
Основным параметром, определяющим успех процедуры кости прививки васкуляризация окрестностях трансплантата. Мы предположили, что имплантация аутокостью бы побудить большее регенерации кости по образованию обильной кровеносных сосудов. Чтобы исследовать эффект трансплантата на неоваскуляризации в дефектной сайта, мы разработали микро-компьютерная томография (μCT) подход для характеристики вновь образующихся кровеносных сосудов, которая включает в себя системную перфузию животного с полимеризацию контрастного вещества. Этот метод позволяет подробную сосудов анализ органа во всей своей полноте. Кроме того, кровоснабжение оценивали с помощью флуоресцентной томографии (FLI) кровеносного происхождения люминесцентной агента. Формирование кости количественно с использованием гидроксиапатита, ориентированные проб и анализ μCT по FLI. Набор стволовых клеток контролировали с помощью биолюминесценции томографии (BLI) в трансгенных мышей, которые экспрессируют люциферазу под контролем промотора остеокальцина.Здесь мы описываем и продемонстрировать подготовку аллотрансплантата, свода черепа дефектов операцию, протоколы сканирования μCT для изучения неоваскуляризации и анализа остеогенеза (в том числе перфузии в естественных условиях контрастного вещества) и протокола для анализа данных.
Анализ 3D высокого разрешения сосудистой продемонстрировали значительно большую ангиогенез у животных с имплантированными аутотрансплантатов, особенно по отношению к образованию артериол. Соответственно, перфузии крови был значительно выше в группе аутотрансплантата 7-й день после операции. Мы наблюдали высокую минерализацию костной ткани и измеренное большее образование костной ткани у животных, получивших аутотрансплантатов. Аутотрансплантата имплантация индуцированной житель набор стволовых клеток в трансплантат костного шва принимающей, где клетки дифференцировались в клетки костной формирования между 7-й и 10-й день после операции. Это открытие означает, что образование костной ткани повышена, могут быть отнесены кдополненная кормления сосудистой, что характеризует аутотрансплантата имплантации. Методы изображен может служить в качестве оптимального инструмента для изучения регенерации кости в терминах плотно ограниченной остеогенеза и неоваскуляризации.
Introduction
Черепно потеря костной из-за травмы, резекции опухоли, декомпрессивной трепанации черепа, и врожденный дефект редко исцеляет сама по себе и представляет четкую клиническую неудовлетворенных потребностей. Аутологичные костные трансплантаты и аллогенных костные трансплантаты широко используются для лечения этих условий 1.
Это широко признано, что остеогенез тесно связан с ангиогенеза 2,3. Таким образом, полное исследование предложенной терапии для регенерации костной ткани должен включать в себя всестороннее расследование сосудистой дерева, образуя на всей территории дефекта. Есть несколько доступных методов характеризуют васкуляризации в научно-исследовательских моделей. Сосудистый дерево может быть исследована гистологического анализа. Так гистология полагается на срезов ткани, существует высокая вероятность того, что полученное изображение будет искажаться. Чтобы решить эту проблему, прижизненной микроскопии может быть выполнена, чтобы изображение без изменений сосудов 4; Однако, этот методограничивается одним-плоскости изображения. μCT сканирование образцов, полученных от животного перфузии контрастного вещества позволяет 3D изображений сосудистой сети, который питает сайт регенерации 5. Такой подход позволяет весьма детальное обоснование сосудистой органа в целом, а также тщательный анализ распределения кровеносных сосудов. Кроме того, μCT позволяет дифференциацию между различными диаметрами сосудов, которые характеризуют различные подтипы кровеносных сосудов.
Мы предположили, что имплантация свода черепа аутотрансплантата будет вызывать большее, чем образование новых сосудов имплантации аллотрансплантата, и это увеличение новых сосудов приведет, в свою очередь, к повышению кости formation.To продолжать эту гипотезу мы использовали различные методы. Мы исследовали образцы вновь образованной сосудистой дерева, выполняя анализ μCT основе. Мы измеряли кровоснабжение помощью крови бассейн флуоресцентный зонд. Далее, мы ослыSed минерализации костной ткани с помощью FLI из гидроксиапатита направленный зонда и анализа μCT. Наконец, мы провели мониторинг набор стволовых клеток и дифференцировки, выполняя BLI в трансгенных мышей, у которых люциферазы выражается в остеокальцина-позитивных клеток.
Protocol
Representative Results
Discussion
Целью мультимодальных подходов, описанных здесь, изображений является обеспечение тщательного расследования оси ангиогенеза остеогенез в контексте черепной костной пластики. Неоваскуляризация была отображена с использованием протокола μCT, что позволило точную высоком разрешении 3…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge funding from the NIDCR (Grant No. DE019902) and from the Israeli Science Foundation (Grant No. 382/13).
Materials
| C57BL/C Mice | Harlan laboratories | 57 | |
| FVB/n Mice | Harlan laboratories | 862 | |
| Phenobarbital | West waro | NDC 0641-0477-25 | |
| Rodent hair clipper | Wahl animal | 8786-451A | |
| Scalpel 11 | Miltex | 27111504 | |
| Dental micro motor | marathon III | ||
| 5mm trephine | Fine Science tools | 18004-50 | |
| Hair removing cream | Veet | ||
| KetaVed (Ketamine) | Vedco | NDC 50989-996-06 | |
| Domitor | Zoetis | NADA 141-267 | |
| carprofen | Norbrook | 02000/4229 | |
| Eye ointment | Puralube | NDC 17033-211-38 | |
| Operating binocular | Kent scientific | KSCXTS-1121 | |
| Fine scissors | Fine Science tools | 14060-11 | |
| Curve tweezers | Fine Science tools | 11274-20 | |
| Spoon shaped spatula | Fine Science tools | 10090-13 | |
| Tisseel Fibin gel kit | Baxter | 718971 | |
| needle holder | Fine Science tools | 12060-01 | |
| vicryl suture 4-0 | Ethicon | J392H | |
| Antisedan | Zoetis | NADA#141033 | |
| Heparin | Sigma | H3393 | |
| 20ml luerlock | BD | 302830 | |
| 23G scalp vein set (butterfly needle) | BD | 367342 | |
| Hemostat | Fine Science tools | 13008-12 | |
| Syringe pump | Harvard apparatus | PHD 2000 | |
| 3sec gel glue | Scotch | ||
| rodent dissection board | Leica | 38DI02313 | |
| Microfil MV-122 | flow-tech | MV-122 | |
| uCT40 scanner | Scanco | uCT40 | |
| TCA6% | Sigma | T6399 | |
| Osteosense 680 | PerkinElmar | NEV10020EX | |
| Angiosense750 | PerkinElmar | NEV10011 | |
| Oxigen 100% medical grade | |||
| isoflurane (furane) | Baxter | 1001936040 | |
| IVIS kinetics | Xenogen | ||
| Beetle luciferin | Promega | E160A |
Riferimenti
- Finkemeier, C. G. Bone-grafting and bone-graft substitutes. J Bone Joint Surg Am. 84-A (3), 454-464 (2002).
- Kanczler, J. M., Oreffo, R. O. Osteogenesis and angiogenesis: the potential for engineering bone. Eur Cell Mater. 15, 100-114 (2008).
- Schipani, E., Maes, C., Carmeliet, G., Semenza, G. L. Regulation of osteogenesis-angiogenesis coupling by HIFs and VEGF. J Bone Miner Res. 24 (8), 1347-1353 (2009).
- Huang, C., et al. Spatiotemporal Analyses of Osteogenesis and Angiogenesis via Intravital Imaging in Cranial Bone Defect. J Bone Miner Res. , (2015).
- Kimelman-Bleich, N., et al. The use of a synthetic oxygen carrier-enriched hydrogel to enhance mesenchymal stem cell-based bone formation in vivo. Biomaterials. 30 (27), 4639-4648 (2009).
- Iris, B., et al. Molecular imaging of the skeleton: quantitative real-time bioluminescence monitoring gene expression in bone repair and development. J Bone Miner Res. 18 (3), 570-578 (2003).
- Bouxsein, M. L., et al. Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography. J Bone Miner Res. 25 (7), 1468-1486 (2010).
- Lim, E., Modi, K. D., Kim, J. In vivo bioluminescent imaging of mammary tumors using IVIS spectrum. J Vis Exp. (26), (2009).
- Kallai, I., et al. Microcomputed tomography-based structural analysis of various bone tissue regeneration models. Nat Protoc. 6 (1), 105-110 (2011).
- Fleming, J. T., et al. Bone blood flow and vascular reactivity. Cells Tissues Organs. 169 (3), 279-284 (2001).
- Dhillon, R. S., et al. PTH-enhanced structural allograft healing is associated with decreased angiopoietin-2-mediated arteriogenesis, mast cell accumulation, and fibrosis. J Bone Miner Res. 28 (3), 586-597 (2013).
- Nebuloni, L., Kuhn, G. A., Vogel, J., Muller, R. A. A novel in vivo vascular imaging approach for hierarchical quantification of vasculature using contrast enhanced micro-computed tomography. PLoS One. 9 (1), e86562 (2014).
- Zhang, X., et al. Periosteal progenitor cell fate in segmental cortical bone graft transplantations: implications for functional tissue engineering. J Bone Miner Res. 20 (12), 2124-2137 (2005).
- Movahed, R., Pinto, L. P., Morales-Ryan, C., Allen, W. R., Wolford, L. M. Application of cranial bone grafts for reconstruction of maxillofacial deformities. Proc (Bayl Univ Med Cent). 26 (3), 252-255 (2013).
- Putters, T. F., Schortinghuis, J., Vissink, A., Raghoebar, G. M. A prospective study on the morbidity resulting from calvarial bone harvesting for intraoral reconstruction. Int J Oral Maxillofac Surg. , (2015).
- Kline, R. M., Wolfe, S. A. Complications associated with the harvesting of cranial bone grafts. Plast Reconstr Surg. 95 (1), 5-13 (1995).
- Hassanein, A. H., et al. Effect of calvarial burring on resorption of onlay cranial bone graft. J Craniofac Surg. 23 (5), 1495-1498 (2012).
- Yin, J., Jiang, Y. Completely resorption of autologous skull flap after orthotopic transplantation: a case report. Int J Clin Exp Med. 7 (4), 1169-1171 (2014).
- Schuss, P., et al. Bone flap resorption: risk factors for the development of a long-term complication following cranioplasty after decompressive craniectomy. J Neurotrauma. 30 (2), 91-95 (2013).
- Ben Arav, A., et al. Adeno-associated virus-coated allografts: a novel approach for cranioplasty. J Tissue Eng Regen Med. 6 (10), e43-e50 (2012).
- Ito, H., et al. Remodeling of cortical bone allografts mediated by adherent rAAV-RANKL and VEGF gene therapy. Nat Med. 11 (3), 291-297 (2005).
- Sheyn, D., et al. PTH promotes allograft integration in a calvarial bone defect. Mol Pharm. 10 (12), 4462-4471 (2013).
- Jain, R. K. Molecular regulation of vessel maturation. Nat Med. 9 (6), 685-693 (2003).
- Reginato, S., Gianni-Barrera, R., Banfi, A. Taming of the wild vessel: promoting vessel stabilization for safe therapeutic angiogenesis. Biochem Soc Trans. 39 (6), 1654-1658 (2011).
- Moutsatsos, I. K., et al. Exogenously regulated stem cell-mediated gene therapy for bone regeneration. Mol Ther. 3 (4), 449-461 (2001).
- Deckers, M. M., et al. Bone morphogenetic proteins stimulate angiogenesis through osteoblast-derived vascular endothelial growth factor. A. Endocrinology. 143 (4), 1545-1553 (2002).
- Cornejo, A., et al. Effect of adipose tissue-derived osteogenic and endothelial cells on bone allograft osteogenesis and vascularization in critical-sized calvarial defects. Tissue Eng Part A. 18 (15-16), 1552-1561 (2012).
