إعداد Thermoresponsive ذات البنية النانومترية السطوح للهندسة الأنسجة
Summary
Nanoscaled sea-island surfaces composed of thermoresponsive block copolymers were fabricated by the Langmuir-Schaefer method for controlling spontaneous cell adhesion and detachment. Both the preparation of the surface and the adhesion and detachment of cells on the surface were visualized.
Abstract
Thermoresponsive poly(N-isopropylacrylamide) (PIPAAm)-immobilized surfaces for controlling cell adhesion and detachment were fabricated by the Langmuir-Schaefer method. Amphiphilic block copolymers composed of polystyrene and PIPAAm (St-IPAAms) were synthesized by reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT) radical polymerization. A chloroform solution of St-IPAAm molecules was gently dropped into a Langmuir-trough apparatus, and both barriers of the apparatus were moved horizontally to compress the film to regulate its density. Then, the St-IPAAm Langmuir film was horizontally transferred onto a hydrophobically modified glass substrate by a surface-fixed device. Atomic force microscopy images clearly revealed nanoscale sea-island structures on the surface. The strength, rate, and quality of cell adhesion and detachment on the prepared surface were modulated by changes in temperature across the lower critical solution temperature range of PIPAAm molecules. In addition, a two-dimensional cell structure (cell sheet) was successfully recovered on the optimized surfaces. These unique PIPAAm surfaces may be useful for controlling the strength of cell adhesion and detachment.
Introduction
وقد جذبت الأسطح ذات البنية النانومترية في الآونة الأخيرة اهتماما كبيرا نظرا لمختلف تطبيقاتها المحتملة، بما في ذلك الزخرفة، زراعة الخلايا، والتنظيف، وتحويل السطح. على سبيل المثال، الأسطح superhydrophobic مستوحاة من البنية النانوية لأوراق اللوتس والأسطح استجابة أخرى قادرة على الاستجابة للمؤثرات الخارجية 1-4.
الفيلم انجميور هي واحدة من الطلاء البوليمر الأكثر دراسة على نطاق واسع. يتم تشكيل فيلم انجميور من خلال إسقاط جزيئات محبة للجهتين على واجهة بين الهواء والماء 5-8. الفيلم يمكن بعد ذلك نقل على سطح صلب عن طريق الامتزاز الفيزيائي أو الكيميائي، والتشكل الجزيئي على سطح صلب يمكن السيطرة عليها باستخدام وسائل نقل الرأسي والأفقي 9-12. كثافة الفيلم انجميور يمكن أن ينظم على وجه التحديد عن طريق ضغط واجهة بين الهواء والماء. في الآونة الأخيرة، وقد أثبتت هذه الطريقة فعالة أيضا لافتعال nanoscaled متطوره البحر جزيرةوفاق من خلال الاستفادة من بوليمرات كتلة محبة للجهتين. ويفترض أن النانو تتكون من مجموعة أساسية من شرائح مسعور وقذيفة من شرائح ماء 13-17. وبالإضافة إلى ذلك، فقد تم ضبط عدد من النانو على سطح عن طريق التحكم في المساحة لكل جزيء (A م) من البوليمرات كتلة في الواجهة.
فقد ركزنا على الأصل، فريدة من نوعها نهج هندسة الأنسجة خالية من سقالة والهندسة ورقة خلية، وذلك باستخدام سطح ثقافة تستجيب للحرارة. وقد تم تطبيق هذه التكنولوجيا المتقدمة لعلاجات التجدد لمختلف الأجهزة 18. كانت ملفقة سطح ثقافة تستجيب للحرارة عن طريق تطعيم بولي (N -isopropylacrylamide) (PIPAAm)، وهو جزيء استجابة درجات الحرارة، على سطح 19-27. PIPAAm وبوليمرات المعرض في درجة حرارة أقل حل الحرجة (LCST) في الأوساط المائية في درجات حرارة قريبة من 32 درجة مئوية. كما عرضت سطح ثقافة alternati استجابة درجات الحرارة على بين للا مائية وhydrophilicity. عند 37 درجة مئوية، وأصبح سطح المطعمة PIPAAm-مسعور، والخلايا تعلق بسهولة وانتشرت على سطح فضلا عن البوليسترين زراعة الأنسجة التقليدية. عندما تم تخفيض درجة الحرارة إلى 20 درجة مئوية، وأصبح سطح ماء، وخلايا منفصلة بشكل عفوي من السطح. لذلك، يمكن أن تحصد خلايا متكدسة مثقف على السطح عبارة عن ورقة سليمة عن طريق تغيير درجة الحرارة. تم عرض هذه الخصائص التصاق الخلايا ومفرزة أيضا سطح ملفقة من قبل طلاء فيلم انجميور للتظاهر مختبر 26 و 27. كانت ملفقة فيلم انجميور من بوليمرات كتلة تتكون من البوليسترين (P (القديس)) وPIPAAm (سانت IPAAm). الفيلم انجميور مع وم معينة يمكن نقلها أفقيا إلى الركيزة الزجاج تعديل hydrophobically. وبالإضافة إلى ذلك، تم تقييم التصاق الخلايا على والابتعاد عن سطح استعداد ردا على درجات الحرارة.
_content "> هنا، نحن تصف بروتوكولات لصنع فيلم انجميور النانوية المؤلفة من بوليمرات كتلة محبة للجهتين الحرارية استجابة على ركيزة الزجاج. لدينا وسيلة يمكن أن توفر تقنية تصنيع فعالة لnanofilms العضوية في مختلف مجالات العلوم السطح ويمكن أن يسهل أكثر السيطرة الفعالة على التصاق الخلايا على ومفرزة عفوية من السطح.Protocol
Representative Results
Discussion
كانت ملفقة سطح تستجيب للحرارة من خلال طريقة انجميور-شايفر، وكان الأمثل لخصائص سطح لالتصاق الخلية / انفصال ورقة خلية الانتعاش. عند استخدام هذه الطريقة لتصنيع الأسطح، عدة خطوات حاسمة. في التركيب الجزيئي للجزيئات سانت IPAAm له تأثير كبير على البنية السطحية واستقرار السطح…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was financially supported by the Creation of Innovation Centers for Advanced Interdisciplinary Research Program’s Project for Developing Innovation Systems “Cell Sheet Tissue Engineering Center (CSTEC)” of the Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology (MEXT), Japan.
Materials
| N-isopropylacrylamide | Kohjin | No catalog number | |
| Azobis(4-cyanovaleric acid) | Wako Pure Chemicals | 016-19332 | |
| Styrene | Sigma-Aldrich | S4972 | |
| 1,3,5-trioxane | Sigma-Aldrich | T81108 | |
| 1,4-Dioxane | Wako Pure Chemicals | 045-24491 | |
| DMEM | Sigma | D6429 | |
| PBS | Nakarai | 11482-15 | |
| Streptomycin | GIBCO BRL | 15140-163 | |
| Penicillin | GIBCO BRL | 15140-122 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma | T4174 | |
| FBS | Japan Bioserum | JBS-11501 | |
| BAECs | Health Science Reserch Resources Bank | JCRB0099 | |
| Cover Glasses | Matsunami Glass Industry | C024501 | |
| AFM NanoScope V | Veeco | ||
| 1H NMR INOVA 400 | Varian, Palo Alto | ||
| ATR/FT-IR NICOLET 6700 | Thermo Scientific | ||
| GPC HLC-8320GPC | Tosoh | ||
| TSKgel Super AW2500, AW3000, AW4000 | Tosoh | ||
| Langmuir-Blodgett Deposition Troughs | KSV Instruments | KN 2002 | KSV NIWA Midium trough |
| Nikon ECLIPSE TE2000-U | Nikon |
Riferimenti
- Bae, Y. H., Kwon, I. C., Pai, C. M., Kim, S. W. Controlled release of macromolecules from electrical and chemical stimuli-responsive hydrogels. Makromol. Chem., Macromol. Symp. 70-71 (1), 173-181 (1993).
- Fu, Q., et al. Reversible control of free energy and topography of nanostructured surfaces. J. Am. Chem. Soc. 126 (29), 8904-8905 (2004).
- Nykanen, A., et al. Phase behavior and temperature-responsive molecular filters based on self-assembly of polystyrene-block-poly(N-isopropylacrylamide)-block-polystyrene. Macromolecules. 40 (16), 5827-5834 (2007).
- Sun, T., et al. Reversible switching between superhydrophilicity and superhydrophobicity. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 43 (3), 357-360 (2004).
- Shuler, R. L., Zisman, W. A. A Study of the behavior of Polyoxyethylene at the air-water interface by wave damping and other methods. J. Phys. Chem. 74 (7), 1523-1534 (1970).
- Kawaguchi, M., Sauer, B. B., Yu, H. Polymeric monolayer dynamics at the air/water interface by surface light scattering. Macromolecules. 22 (4), 1735-1743 (1989).
- Saito, W., Kawaguchi, M., Kato, T., Imae, T. Spreading solvent and temperature effects on interfacial properties of Poly (N-isopropylacrylamide) films at the air-water interface. Langmuir. 7463 (11), 5947-5950 (1996).
- Jheng, K. T., Hsu, W. P. Molecular weight effect of PMMA on its miscibility with PS-b-PEO at the air/water interface. J. App. Polym. Sci. 125 (3), 1986-1992 (2012).
- Biesalski, M. A., Knaebel, A., Tu, R., Tirrell, M. Cell adhesion on a polymerized peptide-amphiphile monolayer. Biomaterials. 27 (8), 1259-1269 (2006).
- Da Silva, A. M. P. S. G., Lopes, S. I. C., Brogueira, P., Prazeres, T. J. V., Beija, M., Martinho, J. M. G. Thermo-responsiveness of poly(N,N-diethylacrylamide) polymers at the air-water interface: The effect of a hydrophobic block. Journal of colloid interface sci. 327 (1), 129-137 (2008).
- Wang, S. Q., Zhu, Y. X. Facile method to prepare smooth and homogeneous polymer brush surfaces of varied brush thickness and grafting density. Langmuir. 25 (23), 13448-13455 (2009).
- Estillore, N. C., Park, J. Y., Advincula, R. C. Langmuir−Schaefer (LS) macroinitiator film control on the grafting of a thermosensitive polymer brush via surface initiated-ATRP. Macromolecules. 43 (16), 6588-6598 (2010).
- Seo, Y. S., et al. Nanowire and mesh conformations of diblock copolymer blends at the air/water interface. Nano Lett. 4 (3), 483-486 (2004).
- Lu, Q., Bazuin, C. G. Solvent-assisted formation of nanostrand networks from supramolecular diblock copolymer/surfactant complexes at the air/water interface. Nano lett. 5 (7), 1309-1314 (2005).
- Nagano, S., Matsushita, Y., Ohnuma, Y., Shinma, S., Seki, T. Formation of a highly ordered dot array of surface micelles of a block copolymer via liquid crystal-hybridized self-assembly. Langmuir. 22 (12), 5233-5236 (2006).
- Perepichka, I. I., Borozenko, K., Badia, A., Bazuin, C. G. Pressure-induced order transition in nanodot-forming diblock. J. Am. Chem. Soc. 133 (493), 19702-19705 (2011).
- Wang, X. L., Ma, X. Y., Zang, D. Y. Aggregation behavior of polystyrene-b-poly(acrylicacid) at the air-water interface. Soft Matter. 9 (2), 443-453 (2013).
- Yamato, M., Okano, T. Cell sheet engineering. Mater. Today. 7 (5), 42-47 (2004).
- Rollason, G., Daviest, J. E., Sefton, M. V. Preliminary report on cell culture on a thermally reversible copolymer. Biomaterials. 14 (2), 153-155 (1993).
- Park, Y. S., Ito, Y., Imanishi, Y. Permeation control through porous membranes immobilized with thermosensitive polymer. Langmuir. 14 (4), 910-914 (1998).
- Kwon, O. H., Kikuchi, A., Yamato, M., Okano, T. Accelerated cell sheet recovery by co-grafting of PEG with PIPAAm onto porous cell culture membranes. Biomaterials. 24 (7), 1223-1232 (2003).
- Kikuchi, A., Okano, T. Nanostructured designs of biomedical materials: applications of cell sheet engineering to functional regenerative tissues and organs. J. Control. Release. 101 (1-3), 69-84 (2005).
- Fukumori, K., et al. Characterization of ultra-thin temperature-responsive polymer layer and its polymer thickness dependency on cell attachment/detachment properties. Macromol. biosci. 10 (10), 1117-1129 (2010).
- Takahashi, H., Nakayama, M., Yamato, M., Okano, T. Controlled chain length and graft density of thermoresponsive polymer brushes for optimizing cell sheet harvest. Biomacromolecules. 11 (8), 1991-1999 (2010).
- Nakayama, M., Yamada, N., Kumashiro, Y., Kanazawa, H., Yamato, M., Okano, T. Thermoresponsive poly(N-isopropylacrylamide)-based block copolymer coating for optimizing cell sheet fabrication. Macromol. Biosci. 12 (6), 751-760 (2012).
- Sakuma, M., et al. Control of cell adhesion and detachment on Langmuir-Schaefer surface composed of dodecyl-terminated thermo-responsive polymers. J. Biomater. Sci., Polym. Ed. 25 (5), 431-443 (2014).
- Sakuma, M., et al. Thermoresponsive nanostructured surfaces generated by the Langmuir-Schaefer method are suitable for cell sheet fabrication. Biomacromolecules. 15 (11), 4160-4167 (2014).
- Moad, G., Chong, Y. K., Postma, A., Rizzardo, E., Thang, S. H. Advances in RAFT polymerization: the synthesis of polymers with defined end-groups. Polymer. 46 (19), 8458-8468 (2005).
- Nishida, K., et al. Corneal Reconstruction with Tissue-Engineered Cell Sheets Composed of Autologous Oral Mucosal Epithelium. N. Engl. J. Med. 351 (12), 1187-1196 (2004).
- Ohki, T., et al. Prevention of esophageal stricture after endoscopic submucosal dissection using tissue-engineered cell sheets. Gastroenterology. 143 (3), 582-588 (2012).
- Sawa, Y., et al. Tissue engineered myoblast sheets improved cardiac function sufficiently to discontinue LVAS in a patient with DCM: report of a case. Surg. Today. 42 (2), 181-184 (2012).
