Doku Mühendisliği Thermoresponsive Nanostructured Yüzeylerin Hazırlanması
Summary
Nanoscaled sea-island surfaces composed of thermoresponsive block copolymers were fabricated by the Langmuir-Schaefer method for controlling spontaneous cell adhesion and detachment. Both the preparation of the surface and the adhesion and detachment of cells on the surface were visualized.
Abstract
Thermoresponsive poly(N-isopropylacrylamide) (PIPAAm)-immobilized surfaces for controlling cell adhesion and detachment were fabricated by the Langmuir-Schaefer method. Amphiphilic block copolymers composed of polystyrene and PIPAAm (St-IPAAms) were synthesized by reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT) radical polymerization. A chloroform solution of St-IPAAm molecules was gently dropped into a Langmuir-trough apparatus, and both barriers of the apparatus were moved horizontally to compress the film to regulate its density. Then, the St-IPAAm Langmuir film was horizontally transferred onto a hydrophobically modified glass substrate by a surface-fixed device. Atomic force microscopy images clearly revealed nanoscale sea-island structures on the surface. The strength, rate, and quality of cell adhesion and detachment on the prepared surface were modulated by changes in temperature across the lower critical solution temperature range of PIPAAm molecules. In addition, a two-dimensional cell structure (cell sheet) was successfully recovered on the optimized surfaces. These unique PIPAAm surfaces may be useful for controlling the strength of cell adhesion and detachment.
Introduction
Nano yapılı yüzeyleri son zamanlarda nedeniyle desenleme, hücre kültürü, temizlik ve yüzey geçiş dahil olmak üzere çeşitli potansiyel uygulamalara önemli ilgisini çekmiştir. Örneğin, Lotus, yaprak ve başka duyarlı yüzeylerin nano esinlenerek süperhidrofobik yüzeyler dış stimuli 1-4'e reaksiyona girebilir.
Langmuir filmi üzerinde en çok çalışılan polimer kaplamaların biridir. Langmuir film, hava-su arayüzünde 5-8 üzerine amfifilik moleküller bırakarak oluşturulur. Film daha sonra fiziksel veya kimyasal adsorpsiyonuyla bir katı yüzey üzerine transfer edilebilir, ve bir katı yüzey üzerinde bir moleküler konformasyon, dikey ve yatay aktarım yöntemleri 9-12 kullanılarak kontrol edilebilir. Langmuir filmin yoğunluğu tam olarak hava-su arayüzü sıkıştırılmasıyla ayarlanabilir. Son zamanlarda, bu yöntem aynı zamanda nano skalasmdaki deniz ada structur imal edilmesi için etkili olduğu kanıtlanmıştıramfifilik blok kopolimerler kullanılarak es. Nano hidrofilik bölümlere bir çekirdek ve hidrofilik kısımlar 13-17 bir kaplamadan oluşmaktadır varsayılır. Buna ek olarak, bir yüzey üzerine nano sayısı ara yüzeyinde blok kopolimerinin molekül başına alanı (A m) kontrol edilmesi suretiyle kontrol edilir.
Biz bir sıcaklık duyarlı kültür yüzey kullanarak, bir orijinal, benzersiz iskele-serbest doku mühendisliği yaklaşımıyla, hücre sac mühendisliği üzerine odaklanmıştır. Geliştirilen teknoloji, çeşitli organlarda 18 için rejeneratif tedaviler uygulanmıştır. Olan, ısıya duyarlı bir kültür yüzey yüzeye 19-27 üzerine poli (N -isopropylacrylamide) (PIPAAm), bir sıcaklık duyarlı molekül, aşılanmasıyla imal edilmiştir. PIPAAm ve kopolimerleri sergiler 32 ° C'ye yakın bir sıcaklıkta sulu ortam, daha düşük bir kritik çözelti sıcaklığı (LCST'nin). Kültür yüzey aynı zamanda bir sıcaklığa duyarlı alternatif akım sergiledi hidrofobiklik ve hidrofilisite arasındaki ilgili. 37 ° C 'de, PIPAAm-aşılı bir yüzey hidrofobik hale geldi ve hücreler hali hazırda bağlanmış ve yüzey üzerinde yanı sıra, geleneksel doku kültürü polistiren üzerinde çoğaldı. Sıcaklık 20 ° C'ye düşürülür zaman, yüzeyi hidrofilik hale geldi ve hücreler kendiliğinden yüzeyinden ayrılmaktadır. Bu nedenle, yüzey üzerinde kültürlenmiş konfluent hücreler sıcaklığı değiştirerek sağlam bir tabaka olarak hasat edilebilir. Bu hücre yapışma ve sıyrılma özellikleri de. Laboratuar gösteri 26, 27, Langmuir film kaplama ile imal edilmiş yüzey sergilendi polistiren (P (St)) ve PIPAAm (St-IPAAm) oluşan blok kopolimerlerinin bir Langmuir filmin imal edilmiştir. Belirli bir m Langmuir Film yatay olarak hidrofobik olarak modifiye edilmiş bir cam alt-tabakaya aktarılabilir. Buna ek olarak, sıcaklığa tepki olarak hazırlanmış yüzeyinden hücre üzerindeki yapışma ve sıyrılma değerlendirildi.
_content "> Burada, bir cam alt-tabaka üzerinde termo-duyarlı amfifilik blok kopolimerlerinden Nano yapısındaki Langmuir filmin imalatı için protokolleri açıklanmıştır. Önerilen yöntem yüzey bilimi çeşitli alanlarda organik nanofilms için etkili bir imalat bir teknik olabilir ve daha çok kolaylaştırabilir hücre yapışması etkili kontrolü ve bir yüzeyden kendiliğinden dekolmanı.Protocol
Representative Results
Discussion
Olan, ısıya duyarlı bir yüzey Langmuir-Schaefer yöntemi ile imal edilmiş, ve hücre yapışması / sökme ve hücre yapraklan geri kazanımı için yüzey özellikleri optimize edilmiştir. yüzeylerin imalatı için bu yöntemi kullanırken, birkaç adım çok önemlidir. St-IPAAm moleküllerinin moleküler bileşim olup, hücre yapışması ve ayrılması yüzey yapısı üzerinde büyük bir etkiye ve yüzey stabilitesini, ve dolayısıyla, yer alır. Özellikle, St-IPAAm molekülleri dar bir molekül ağırlı…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was financially supported by the Creation of Innovation Centers for Advanced Interdisciplinary Research Program’s Project for Developing Innovation Systems “Cell Sheet Tissue Engineering Center (CSTEC)” of the Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology (MEXT), Japan.
Materials
| N-isopropylacrylamide | Kohjin | No catalog number | |
| Azobis(4-cyanovaleric acid) | Wako Pure Chemicals | 016-19332 | |
| Styrene | Sigma-Aldrich | S4972 | |
| 1,3,5-trioxane | Sigma-Aldrich | T81108 | |
| 1,4-Dioxane | Wako Pure Chemicals | 045-24491 | |
| DMEM | Sigma | D6429 | |
| PBS | Nakarai | 11482-15 | |
| Streptomycin | GIBCO BRL | 15140-163 | |
| Penicillin | GIBCO BRL | 15140-122 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma | T4174 | |
| FBS | Japan Bioserum | JBS-11501 | |
| BAECs | Health Science Reserch Resources Bank | JCRB0099 | |
| Cover Glasses | Matsunami Glass Industry | C024501 | |
| AFM NanoScope V | Veeco | ||
| 1H NMR INOVA 400 | Varian, Palo Alto | ||
| ATR/FT-IR NICOLET 6700 | Thermo Scientific | ||
| GPC HLC-8320GPC | Tosoh | ||
| TSKgel Super AW2500, AW3000, AW4000 | Tosoh | ||
| Langmuir-Blodgett Deposition Troughs | KSV Instruments | KN 2002 | KSV NIWA Midium trough |
| Nikon ECLIPSE TE2000-U | Nikon |
Riferimenti
- Bae, Y. H., Kwon, I. C., Pai, C. M., Kim, S. W. Controlled release of macromolecules from electrical and chemical stimuli-responsive hydrogels. Makromol. Chem., Macromol. Symp. 70-71 (1), 173-181 (1993).
- Fu, Q., et al. Reversible control of free energy and topography of nanostructured surfaces. J. Am. Chem. Soc. 126 (29), 8904-8905 (2004).
- Nykanen, A., et al. Phase behavior and temperature-responsive molecular filters based on self-assembly of polystyrene-block-poly(N-isopropylacrylamide)-block-polystyrene. Macromolecules. 40 (16), 5827-5834 (2007).
- Sun, T., et al. Reversible switching between superhydrophilicity and superhydrophobicity. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 43 (3), 357-360 (2004).
- Shuler, R. L., Zisman, W. A. A Study of the behavior of Polyoxyethylene at the air-water interface by wave damping and other methods. J. Phys. Chem. 74 (7), 1523-1534 (1970).
- Kawaguchi, M., Sauer, B. B., Yu, H. Polymeric monolayer dynamics at the air/water interface by surface light scattering. Macromolecules. 22 (4), 1735-1743 (1989).
- Saito, W., Kawaguchi, M., Kato, T., Imae, T. Spreading solvent and temperature effects on interfacial properties of Poly (N-isopropylacrylamide) films at the air-water interface. Langmuir. 7463 (11), 5947-5950 (1996).
- Jheng, K. T., Hsu, W. P. Molecular weight effect of PMMA on its miscibility with PS-b-PEO at the air/water interface. J. App. Polym. Sci. 125 (3), 1986-1992 (2012).
- Biesalski, M. A., Knaebel, A., Tu, R., Tirrell, M. Cell adhesion on a polymerized peptide-amphiphile monolayer. Biomaterials. 27 (8), 1259-1269 (2006).
- Da Silva, A. M. P. S. G., Lopes, S. I. C., Brogueira, P., Prazeres, T. J. V., Beija, M., Martinho, J. M. G. Thermo-responsiveness of poly(N,N-diethylacrylamide) polymers at the air-water interface: The effect of a hydrophobic block. Journal of colloid interface sci. 327 (1), 129-137 (2008).
- Wang, S. Q., Zhu, Y. X. Facile method to prepare smooth and homogeneous polymer brush surfaces of varied brush thickness and grafting density. Langmuir. 25 (23), 13448-13455 (2009).
- Estillore, N. C., Park, J. Y., Advincula, R. C. Langmuir−Schaefer (LS) macroinitiator film control on the grafting of a thermosensitive polymer brush via surface initiated-ATRP. Macromolecules. 43 (16), 6588-6598 (2010).
- Seo, Y. S., et al. Nanowire and mesh conformations of diblock copolymer blends at the air/water interface. Nano Lett. 4 (3), 483-486 (2004).
- Lu, Q., Bazuin, C. G. Solvent-assisted formation of nanostrand networks from supramolecular diblock copolymer/surfactant complexes at the air/water interface. Nano lett. 5 (7), 1309-1314 (2005).
- Nagano, S., Matsushita, Y., Ohnuma, Y., Shinma, S., Seki, T. Formation of a highly ordered dot array of surface micelles of a block copolymer via liquid crystal-hybridized self-assembly. Langmuir. 22 (12), 5233-5236 (2006).
- Perepichka, I. I., Borozenko, K., Badia, A., Bazuin, C. G. Pressure-induced order transition in nanodot-forming diblock. J. Am. Chem. Soc. 133 (493), 19702-19705 (2011).
- Wang, X. L., Ma, X. Y., Zang, D. Y. Aggregation behavior of polystyrene-b-poly(acrylicacid) at the air-water interface. Soft Matter. 9 (2), 443-453 (2013).
- Yamato, M., Okano, T. Cell sheet engineering. Mater. Today. 7 (5), 42-47 (2004).
- Rollason, G., Daviest, J. E., Sefton, M. V. Preliminary report on cell culture on a thermally reversible copolymer. Biomaterials. 14 (2), 153-155 (1993).
- Park, Y. S., Ito, Y., Imanishi, Y. Permeation control through porous membranes immobilized with thermosensitive polymer. Langmuir. 14 (4), 910-914 (1998).
- Kwon, O. H., Kikuchi, A., Yamato, M., Okano, T. Accelerated cell sheet recovery by co-grafting of PEG with PIPAAm onto porous cell culture membranes. Biomaterials. 24 (7), 1223-1232 (2003).
- Kikuchi, A., Okano, T. Nanostructured designs of biomedical materials: applications of cell sheet engineering to functional regenerative tissues and organs. J. Control. Release. 101 (1-3), 69-84 (2005).
- Fukumori, K., et al. Characterization of ultra-thin temperature-responsive polymer layer and its polymer thickness dependency on cell attachment/detachment properties. Macromol. biosci. 10 (10), 1117-1129 (2010).
- Takahashi, H., Nakayama, M., Yamato, M., Okano, T. Controlled chain length and graft density of thermoresponsive polymer brushes for optimizing cell sheet harvest. Biomacromolecules. 11 (8), 1991-1999 (2010).
- Nakayama, M., Yamada, N., Kumashiro, Y., Kanazawa, H., Yamato, M., Okano, T. Thermoresponsive poly(N-isopropylacrylamide)-based block copolymer coating for optimizing cell sheet fabrication. Macromol. Biosci. 12 (6), 751-760 (2012).
- Sakuma, M., et al. Control of cell adhesion and detachment on Langmuir-Schaefer surface composed of dodecyl-terminated thermo-responsive polymers. J. Biomater. Sci., Polym. Ed. 25 (5), 431-443 (2014).
- Sakuma, M., et al. Thermoresponsive nanostructured surfaces generated by the Langmuir-Schaefer method are suitable for cell sheet fabrication. Biomacromolecules. 15 (11), 4160-4167 (2014).
- Moad, G., Chong, Y. K., Postma, A., Rizzardo, E., Thang, S. H. Advances in RAFT polymerization: the synthesis of polymers with defined end-groups. Polymer. 46 (19), 8458-8468 (2005).
- Nishida, K., et al. Corneal Reconstruction with Tissue-Engineered Cell Sheets Composed of Autologous Oral Mucosal Epithelium. N. Engl. J. Med. 351 (12), 1187-1196 (2004).
- Ohki, T., et al. Prevention of esophageal stricture after endoscopic submucosal dissection using tissue-engineered cell sheets. Gastroenterology. 143 (3), 582-588 (2012).
- Sawa, Y., et al. Tissue engineered myoblast sheets improved cardiac function sufficiently to discontinue LVAS in a patient with DCM: report of a case. Surg. Today. 42 (2), 181-184 (2012).
