سريع الهواء الجاف اسقاط كروموسوم طريقة التحضير مناسبة لFISH في النباتات
Summary
A protocol is described for the preparation of high-quality mitotic plant chromosome spreads by a fast air-dry dropping method suitable for the FISH detection of single and high copy DNA probes.
Abstract
إعداد ينتشر الكروموسومات هي شرط أساسي لنجاح أداء مضان في الموقع التهجين (FISH). إعداد جودة عالية ينتشر كروموسوم مصنع يمثل تحديا بسبب جدار الخلية جامدة. إحدى الطرق المعتمدة لإعداد الصبغيات النباتية هو ما يسمى إعداد قطرة، المعروف أيضا باسم نشر قطرة أو تقنية تجفيف الهواء. هنا، نقدم بروتوكول لإعداد سريع من كروموسوم الإنقسامية ينتشر مناسبة للكشف FISH تحقيقات DNA نسخة واحدة والعالية. هذا الأسلوب هو البديل الأفضل للطريقة قطرة الهواء الجاف المنفذة بموجب عقد الرطوبة النسبية من 50٪ -55٪. ويتألف هذا البروتوكول انخفاض عدد غسل خطوات صنع تطبيقه سهلة وفعالة وقابلة للتكرار. فوائد واضحة لهذا النهج بشكل جيد الانتشار، الكروموسومات الطورية التالفة والعديد من العاملين كشرط مسبق مثالية لتحليل FISH ناجحة. باستخدام هذا البروتوكول حصلنا عالية الجودة الكرومosome ينتشر والنتائج FISH استنساخه لفولغاري شعير، H. bulbosum، H. marinum، H. murinum، H. pubiflorum والشيلم cereale.
Introduction
مضان التهجين في الموقع (FISH) في هو أداة فعالة لرسم خرائط المادي للتسلسل نسخة واحدة وعالية على مستوى الكروموسومات. شرط أساسي هو إعداد ينتشر كروموسوم جودة عالية. ليس هناك كروموسوم العام إعداد بروتوكول التي من شأنها أن تكون مناسبة أيضا للخلايا الحيوانية والنباتية. إعداد الكروموسومات المصنع هو تحديا من نوع خاص بسبب جدار الخلية جامدة ومختلف الاتساق السيتوبلازم داخل الأنواع المختلفة. إحدى الطرق الملائمة لإعداد الصبغيات النباتية هو ما يسمى تقنية انخفاض المعروف أيضا باسم تقنية الانتشار قطرة وتجفيف الهواء تقنية 1،2. وقدم هذه الطريقة لأول مرة في عام 1958 من قبل Rothfels وSiminovitch لفي المختبر خلايا الثدييات نمت 3. في وقت لاحق مارتن وآخرون. (4) وكاتو وآخرون. 5 تكييف هذه الطريقة للنباتات.
وفي الآونة الأخيرة، وهي طريقة تسمى "SteamDrop &# 39؛ وقد وضعت والتي تستخدم البخار المياه لإعداد الكروموسومات غير متداخلة 6. على الرغم من أن لوحظ تأثير إيجابي من ارتفاع نسبة الرطوبة في وقت سابق من 7، 'SteamDrop' يسلم سير العمل الخاضعة للرقابة ذات جودة عالية التحضيرات كروموسوم 6. يؤدي العلاج بالبخار تمتد من الكروموسومات ربما تتصل بعض التعديلات من البروتينات الكروموسومات. نوعية الناتج ينتشر الطورية عالية جدا، على الرغم من الاحتفاظ بعدد كاف من الطورية ينتشر كاملة للتجارب FISH اللاحقة يطالب الخبرة التقنية.
هنا نقدم بروتوكول لإعداد الكروموسومات الإنقسامية الحبوب مناسبة للكشف FISH من واحد ونسخة عالية تحقيقات 5،8. هذا الأسلوب هو البديل الأفضل للطريقة إسقاط الهواء الجاف وصفه كاتو 9 تتم تحت الرطوبة النسبية من 50٪ -55٪ (الشكل 1). ويتألف هذا البروتوكول عددا أقلغسل خطوات صنع تطبيقه سهلة وفعالة وقابلة للتكرار. باستخدام هذا البروتوكول حصلنا على هوامش كروموسوم ذات جودة عالية ونتائج FISH لفولغاري شعير، H. bulbosum، H. marinum، H. murinum، H. pubiflorum والشيلم cereale.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد تم تنفيذ التجربة إعداد كروموسوم من استخدام جذور الشباب من الحبوب تعود لعائلة الأعشاب (النجيلية). جميع الأنواع تحليل لها 14 الإنقسامية طويلة نسبيا الكروموسومات الطورية (11-15 ميكرون) في مجموعة الجينوم مضاعفا وتنتمي إلى الأنواع واسع الجينوم (5،1-7،9 GBP).
<p class="jove_content" sty…Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We gratefully thank the DFG for financial support (HO 1779/21-1) as well as Katrin Kumke and Dr. Veit Schubert (IPK, Gatersleben) for technical advice.
Materials
| Hot Plate | MEDAX GmbH | 12603 | |
| Cellulase R10 | Duchefa | C8001 | |
| Cellulase | CalBioChem | 219466 | |
| Pectolyase | Sigma | P3026 | |
| Cytohelicase | Sigma | C8274 | |
| Texas Red-12-dUTP | Invitrogen | C3176 | direct fluorochrome |
| Fluor488-5-dUTP | Invitrogen | C11397 | direct fluorochrome |
| Fluorecsence microscope | Olympus BX61 | BX61 | |
| CCD camera | Orca ER, Hamamatsu | C10600 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Vector Laboratories | H-1200 | fluorecsent dye |
Riferimenti
- Geber, G., Schweizer, D. Cytochemical heterochromatin differentiation in Sinapis alba (Cruciferae) using a simple air-drying technique for producing chromosome spreads. Pl Syst Evol. 158 (2-4), 97-106 (1988).
- Andras, S. C., et al. A drop-spreading technique to produce cytoplasm-free mitotic preparations from plants with small chromosomes. Chromosome Res. 7 (8), 641-647 (1999).
- Rothfels, K. H., Siminovitch, L. An air-drying technique for flattening chromosomes in mammalian cells grown in vitro. Stain Technology. 33 (2), 73-77 (1958).
- Martin, R., Busch, W., Herrmann, R. G., Wanner, G. Efficient preparation of plant chromosomes for high-resolution scanning electron microscopy. Chromosome Res. 2 (5), 411-415 (1994).
- Kato, A., Albert, P. S., Vega, J. M., Birchler, J. A. Sensitive fluorescence in situ hybridization signal detection in maize using directly labeled probes produced by high concentration DNA polymerase nick translation. Biotech. Histochem. 81 (2-3), 71-78 (2006).
- Kirov, I., Divashuk, M., Van Laere, K., Soloviev, A., Khrustaleva, L. An easy ‘SteamDrop’ method for high quality plant chromosome preparation. Mol. Cytogenet. 7, 21 (2014).
- Spurbeck, J. L., Zinsmeister, A. R., Meyer, K. J., Jalal, S. M. Dynamics of chromosome spreading. Am J Med Genet. 61 (4), 387-393 (1996).
- Ma, L., et al. Synteny between Brachypodium distachyon and Hordeum vulgare as revealed by FISH. Chromosome Res. 18 (7), 841-850 (2010).
- Kato, A., Lamb, J. C., Birchler, J. A. Chromosome painting using repetitive DNA sequences as probes for somatic chromosome identification in maize. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 101 (37), 13554-13559 (2004).
- Pan, W. H., Houben, A., Schlegel, R. Highly effective cell synchronization in plant-roots by hydroxyurea and amiprophos-methyl or colchicine. Genome. 36 (2), 387-390 (1993).
- Kim, J. S., et al. Integrated karyotyping of sorghum by in situ hybridization of landed BACs. Genome. 45 (2), 402-412 (2002).
- Lapitan, N. L. V., Brown, S. E., Kennard, W., Stephens, J. L., Knudson, D. L. FISH physical mapping with barley BAC clones. Plant J. 11 (1), 149-156 (1997).
- Aliyeva-Schnorr, L., et al. Cytogenetic mapping with centromeric BAC contigs shows that this recombination-poor region comprises more than half of barley chromosome 3H. Plant J. 84, 385-394 (2015).
