الستار العمود تدفق: تحسين الكفاءة والحساسية
Summary
Here, we present a protocol for the operation and optimization of Active Flow Technology (AFT) column in Curtain flow (CF) mode for enhanced separation performance.
Abstract
Active Flow Technology (AFT) is a form of column technology that increases the separation performance of a HPLC column through the use of a specially purpose built multiport end-fitting(s). Curtain Flow (CF) columns belong to the AFT suite of columns, specifically the CF column is designed so that the sample is injected into the radial central region of the bed and a curtain flow of mobile phase surrounding the injection of solute prevents the radial dispersion of the sample to the wall. The column functions as an ‘infinite diameter’ column. The purpose of the design is to overcome the radial heterogeneity of the column bed, and at the same time maximize the sample load into the radial central region of the column bed, which serves to increase detection sensitivity. The protocol described herein outlines the system and CF column set up and the tuning process for an optimized infinite diameter ‘virtual’ column.
Introduction
في السنوات الأخيرة، التكنولوجيا المتقدمة العمود عالية الأداء اللوني السائل (HPLC) إلى حد كبير؛ زادت قدرات الذروة إلى حد كبير إلى حد كبير بفضل استخدام أحجام الجسيمات الأصغر حجما وأكثر كفاءة الجسيمات الأساسية قذيفة. منذ الانفصال عادة ما تكون أكثر كفاءة، وقد تدفق على أثر زيادة في حساسية منذ القمم هي الآن أكثر وضوحا، وبالتالي اطول 1-8.
ومع ذلك، عدم التجانس السرير شعاعي لا يزال عاملا مقيدا في أداء جميع الأعمدة، ولكن هذه ليست قصة جديدة منذ chromatographers ويعرف هذا لسنوات عديدة. سرير عمود غير متجانسة في كل من الاتجاه شعاعي 12/09، وعلى طول العمود محور 10،12-15. للتأثير الجدار خصوصا ومساهما هاما في فقدان 7،16-18 أداء الانفصال. Shalliker وريتشي 7 استعرضت مؤخرا جوانب عدم التجانس عمود السرير وبالتالي هذا لا يلزم أن يكون discusseد هنا أبعد من ذلك. على الرغم من أن يكفي القول، أن الاختلاف في العمود كثافة السرير التعبئة والتغليف وآثار جدار يؤدي إلى تشويه المكونات المذاب، ان هذه العصابات أزل من خلال العمود في المقابس، وتماثل مملوءة جزئيا الحساء الأطباق بدلا من رقيقة أقراص صلبة مسطحة 7 التي هي يصور عادة في النصوص التعليمية الأساسية. عندما أجريت تجارب من هذا القبيل أن الهجرة المذاب من خلال السرير يمكن تصور كانت لمحات المكونات داخل العمود جوفاء جزئيا وقسم المخلفات في الفرقة هو إلى حد كبير مكون جدار المكونات العينة. والنتيجة النهائية هي أنه يأخذ الكثير من لوحات لفصل هذه المقابس "جوفاء جزئيا" من شأنه أن يكون مطلوبا إذا كانت أقراص صلبة ومسطحة 12،14،17. للتغلب على الفرقة توسيع القضايا المرتبطة آثار الجدار والاختلاف في كثافة التعبئة شعاعي، وقد تم تصميم شكل جديد من التكنولوجيا العمود المعروفة باسم النشطين تقنية التدفق (AFT) 7،19. وكان الهدف من هذا التصميملإزالة آثار الجدار من خلال الفصل المادي بين يبلغ حجمه المذيبات على طول منطقة الجدار، من أن من الطور المتحرك يبلغ حجمه في المنطقة الوسطى شعاعي العمود 19. هناك نوعان رئيسيان من الأعمدة AFT. موازية مقطع التدفق (PSF) الأعمدة والستار تدفق (CF) أعمدة 7. منذ يهدف هذا البروتوكول في استخدام والاستفادة المثلى من الأعمدة CF، لن يتم مواصلة مناقشة الأعمدة قوات الأمن الفلسطينية.
الستار تدفق (CF)
الستار تدفق (CF) صيغ العمود الاستفادة AFT-التجهيزات نهاية في كل من مدخل ومخرج العمود. تتكون AFT نهاية التجهيزات لفريت الحلقي تقع داخل تركيب متعدد المنافذ. ويتكون فريت تتكون من ثلاثة أجزاء: الجزء المركزي شعاعي يسهل اختراقها والتي تتماشى مع الميناء الرئيسي للنهاية المناسب، وهو الجزء الخارجي يسهل اختراقها والتي تتماشى مع ميناء الطرفية (ق) من نهاية مناسبة، وحلقة كتيمة أن يفصل بين الأجزاء التي يسهل اختراقها منع أي عبر-flow بين المنطقتين الوسطى والخارجية شعاعي للفريت 19 الشكل 1 يوضح تصميم فريت الخلف ويوضح الشكل 2 الشكل العمود CF. في هذا النمط من العمليات (CF) يتم حقن العينة إلى ميناء المركزي شعاعي من مدخل المناسب، في حين يتم إدخال الطور المتحرك إضافية عن طريق ميناء الطرفية من مدخل إلى 'ستار' هجرة المواد المذابة من خلال المنطقة الوسطى شعاعي لل عمود. ومن هنا يدخل عينة السرير في المنطقة الوسطى الشعاعية للعمود مع المنطقة الخارجية للعمود وجود الطور المتحرك مرت فقط من خلال ذلك. وقد أظهرت الدراسات أن نسبة حجمية معدل تدفق حوالي 40:60 (وسط: منفذ الطرفية) لمدخل نهاية تركيب عمود 4.6 مم القطر الداخلي (معرف) هو 6،7،16 الأمثل. منفذ الخلف العمود CF يسمح تعديل تدفق المركزي والمحيطي لجزء نسبي ويمكن أن تختلف إلى ما يقرب من أي راتي المطلوبس من خلال إدارة الضغوط. الاستفادة المثلى من عمود CF يمكن أن تحسن بشكل كبير الجوانب الفنية المختلفة للتكنولوجيا العمود، مثل كفاءة الفصل أو حساسية الكشف. في هذه الطريقة يتم تأسيس "الجدار أقل '،' لا حصر له القطر" أو عمود "الظاهري" 6،10،18،20. والغرض من الأعمدة CF هو إدارة بنشاط في الهجرة من العينة من خلال العمود لمنع عينة من الوصول إلى منطقة الجدار. وبالتالي، يتم تكبير تركيز المذاب عند الخروج إلى كشف، وزيادة حساسية أكبر نحو 2.5 مرة من شكل العمود التقليدي عند استخدام الأشعة فوق البنفسجية (UV) كشف 16، وحتى أكبر عند استخدام الكشف الطيفي الشامل 6.
هي مناسبة الأعمدة CF مثالي لعينات التركيز المنخفض، حيث تزداد حساسية الكشف. وعلاوة على ذلك، فهي مثالية عندما يقترن إلى معدل التدفق للكشف عن محدودة، مثل مطياف الكتلة (MS) 6. [أالعمود FT في شكل معرف 4.6 مم، على سبيل المثال يمكن ضبطها لتقديم نفس الحجم من المذيب لكشف باعتباره 2.1 ملم عمود شكل معيار الهوية عندما كانت تعمل في نفس السرعات الخطية، من خلال تعديل الخروج تدفق المركزي إلى 21٪. وبالمثل العمود الخلف كما يمكن ضبطها لتسليم نفسه تحميل الصوت إلى جهاز الكشف عن كعمود معرف 3.0 ملم، من خلال تعديل الخروج تدفق المركزي إلى 43٪. في الواقع يمكن أن تنتج أي شكل عمود "التقديرية" لتتناسب مع متطلبات التحليلي 6،18،22. باستخدام هذه نهاية التجهيزات المصممة خصيصا في مدخل ومخرج يضمن أن يتم إنشاء عمود صحيح الجدار أقل.
هناك طريقتان لإعداد نظام تسليم المذيبات إلى موانئ المركزية والطرفية للمدخل: نظام تقسيم تدفق 6 واثنين من 6،7 نظام مضخة الشكل 3 يوضح كل من هذه المجموعة المنبثقة نظام CF.
نظام تقسيم التدفق
أناغ نظام تقسيم التدفق (الشكل 3A) تدفق المضخة مما يؤدي إلى حاقن منقسمون ما قبل حاقن باستخدام ميت الصفر حجم T-قطعة، حيث يتم توصيل تيار تدفق واحد من الطور المتحرك لحاقن، وهو بعد ذلك متصلا ميناء المركزي للمدخل نهاية تركيب العمود. تيار تدفق الثاني من المرحلة المتنقلة، يمر حاقن ويرتبط إلى ميناء الطرفية على مدخل العمود. خلال تقسيم التدفق، ويتم تعديل نسبة تدفق تدفق إلى 40:60 (مركز: الطرفية) قبل أن يتم توصيل خطوط العمود، أي من حاقن لمركز ومضخة لالطرفية.
نظام ثنائي مضخة
يتطلب العمود CF تيارين التدفق في مدخل نهاية تركيب العمود. اعتمادا على نوع من الاوتوماتيكى / حاقن للHPLC أداة، وانقسام تدفق اقامة قد لا يكون من الممكن، وهكذا CF ويمكن بعد ذلك أن يتحقق من خلال 2 مضخات (الشكل 3B 21). يخصص لكل مضخة وتوصيلها الى ميناء المركزي أو الطرفي ويتم تعيين معدل التدفق لتمثيل 40٪ من تدفق لميناء المركزي و 60٪ لميناء الطرفية. على سبيل المثال، إذا كان معدل تدفق 1.0 مل دقيقة -1، يتم تعيين معدل تدفق ضخ المركزي إلى 0.4 مل دقيقة -1 ويتم تعيين مضخة الطرفية إلى 0.6 مل دقيقة -1.
واختيار أي طريقة عملها يعتمد إلى حد كبير على أجهزة HPLC ووضع الكروماتوغرافي من العملية. على سبيل المثال في بعض autosamplers تغيير في الضغط بين عينة موقف الحمل وعينة حقن قد يحدث موقف تعطيل نسبة الانقسام التدفق وبالتالي في هذه الحالة مضخة مزدوجة انشاء أن يكون الموصى بها لأداء CF الأمثل. بغض النظر عن نظام تسليم المذيبات اقامة المختار للمدخل العمود CF، ومنفذ الأمثل CF لا يزال هو نفسه. ويرد ميناء المركزي منفذ العمود CF إلى كاشف الأشعة فوق البنفسجية-مرئي (أشعة فوق البنفسجية فيس) مع األصغرخشية أن حجم ممكن من الأنابيب للحد من آثار ما بعد العمود حجم القتلى. منذ ذلك الحين، أعمدة CF محاكاة أعمدة ضيقة الجوف، حجم القتلى بين منفذ عمود وكاشف هو ضار لأداء فصل العمود CF. فمن الأهمية بمكان لضمان أقل قدر من حجم أنابيب بين ميناء المركزي وكاشف للأشعة فوق البنفسجية فيس للحد من آثار حجم القتلى مثل توسيع النطاق، وفقدان الكفاءة وحساسية. وبالتالي، ينصح استخدام أنابيب تتحمل الضيق (0.1 ملم معرف) للسماح بسهولة التعديلات الضغط دون إضافة حجم القتلى غير مناسب. ويرد الأنابيب أيضا إلى ميناء الطرفية وإخراج سدى. على منفذ العمود CF، نسبة تجزئة يمكن تعديلها في أي النسبة التي تناسب الغرض من المحللين. عند استخدام معرف CF 4.6 مم، على سبيل المثال، غالبا ما يكون ملائم لتعيين نسبة إما 43:57 أو 21:79 (مركز: الطرفية) لمضاهاة "الظاهري" 3.0 ملم عمود الهوية أو 2.1 ملم عمود الهوية،باحترام. بهذه الطريقة أداء الانفصال بسهولة بعلامات مقاعد البدلاء. يتم قياس نسبة تجزئة وزنها عن طريق كمية تدفق الخروج من الكشف الذي يتم توصيله بمنفذ المركزي وتدفق الخروج من ميناء الطرفية خلال فترة زمنية. تدفق مئوية خلال كل منفذ يمكن بعد ذلك يتم تحديد ونسب يمكن تعديلها عن طريق تغيير طول الأنبوب المرفقة أو باستخدام الأنابيب التي يبلغ قطرها الداخلي مختلفة (معرف).
تفاصيل هذا البروتوكول الفيديو إجراءات عملية والاستغلال الأمثل للعمود CF من أجل تحسين الأداء الكروماتوغرافي.
Protocol
Representative Results
Discussion
وشملت هذه الدراسة تحليل بين المختبرات الأعمدة اللوني CF لاختبار الأداء التحليلي من حيث الكفاءة والحساسية. تم تعيين عمود CF مع نظام الضخ المزدوج كما هو موضح في قسم "3. تعيين نظام مضخة مزدوجة تصل إلى تحقيق نسبة تدفق 40:60 (مركز: الطرفية) على مدخل العمود CF. وقد تحقق نسبة التد…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
One of the authors (DK) acknowledges the receipt of an Australian Postgraduate Award.
Materials
| HPLC instrument | |||
| Additional Pump | Required if 2 pump CF system set up is to be used. | ||
| Curtain Flow HPLC column | Thermo Fisher Scientific | Not Defined | Soon to be commercialised |
| Methanol | Any brand | HPLC Grade | |
| PEEK tubing | Any brand | Various lengths and i.d. | |
| PEEK tube cutter | Any brand | ||
| Analytical Scale Balance | Any brand | ||
| Stop watch | Any brand | ||
| Eluent collection vessels | Any brand | 1-2 mL Sample vials can be used as eluent collection vessels | |
| T-piece | Any brand |
References
- Camenzuli, M., et al. The use of parallel segmented outlet flow columns for enhanced mass spectral sensitivity at high chromatographic flow rates. Rapid Commun. Mass Sp. 26 (8), 943-949 (2012).
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. Enhanced separation performance using a new column technology: Parallel segmented outlet flow. J. Chromatogr. A. 1232, 47-51 (2012).
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Shalliker, R. A. Gradient elution chromatography with segmented parallel flow column technology: A study on 4.6mm analytical scale columns. J. Chromatogr. A. 1270, 204-211 (2012).
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Shalliker, R. A. Improving HPLC separation performance using parallel segmented flow chromatography. Microchem. J. 111, 3-7 (2013).
- Camenzuli, M., et al. Parallel segmented outlet flow high performance liquid chromatography with multiplexed detection. Anal. Chim. Acta. 803, 154-159 (2013).
- Kocic, D., et al. High through-put and highly sensitive liquid chromatography-tandem mass spectrometry separations of essential amino acids using active flow technology chromatography columns. J. Chromatogr. A. 1305, 102-108 (2013).
- Shalliker, R. A., Ritchie, H. Segmented flow and curtain flow chromatography: Overcoming the wall effect and heterogeneous bed structures. J. Chromatogr. A. 1335, 122-135 (2014).
- Shellie, R., Haddad, P. Comprehensive two-dimensional liquid chromatography. Anal. Bioanal. Chem. 386 (3), 405-415 (2006).
- Abia, J. A., Mriziq, K. S., Guiochon, G. A. Radial heterogeneity of some analytical columns used in high-performance liquid chromatography. J. Chromatogr. A. 1216 (15), 3185-3191 (2009).
- Knox, J. H., Laird, G. R., Raven, P. A. Interaction of radial and axial dispersion in liquid chromatography in relation to the "infinite diameter effect". J. Chromatogr. A. 122, 129-145 (1976).
- Miyabe, K., Guiochon, G. Estimation of the column radial heterogeneity from an analysis of the characteristics of tailing peaks in linear chromatography. J. Chromatogr. A. 830 (1), 29-39 (1999).
- Shalliker, R. A., Scott Broyles, B., Guiochon, G. Axial and radial diffusion coefficients in a liquid chromatography column and bed heterogeneity. J. Chromatogr. A. 994 (1-2), 1-12 (2003).
- Gritti, F., Guiochon, G. Effects of the thermal heterogeneity of the column on chromatographic results. J. Chromatogr. A. 1131 (1-2), 151-165 (2006).
- Shalliker, R. A., Wong, V., Broyles, B. S., Guiochon, G. Visualization of bed compression in an axial compression liquid chromatography column. J. Chromatogr. A. 977 (2), 213-223 (2002).
- Tallarek, U., Albert, K., Bayer, E., Guiochon, G. Measurement of transverse and axial apparent dispersion coefficients in packed beds. AICHE J. 42 (11), 3041-3054 (1996).
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. Active flow management in preparative chromatographic separations: A preliminary investigation into enhanced separation using a curtain flow inlet fitting and segmented flow outlet. J. Sep. Sci. 35 (3), 410-415 (2012).
- Shalliker, R. A., Broyles, B. S., Guiochon, G. Physical evidence of two wall effects in liquid chromatography. J. Chromatogr. A. 888 (1-2), 1-12 (2000).
- Shalliker, R. A., Camenzuli, M., Pereira, L., Ritchie, H. J. Parallel segmented flow chromatography columns: Conventional analytical scale column formats presenting as a ‘virtual’ narrow bore column. J. Chromatogr. A. 1262, 64-69 (2012).
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. The design of a new concept chromatography column. Analyst. 136 (24), 5127-5130 (2011).
- Foley, D., et al. Precision and Reliability: an Intercontinental Study of Curtain Flow Chromatography. Thermo Scientific. , (2013).
- Pravadali-Cekic, S. Multidimensional Approaches for the Analysis of Complex Samples using HPLC. University of Western Sydney. , (2014).
- Soliven, A., et al. Improving the performance of narrow-bore HPLC columns using active flow technology. Microchem. J. 116, 230-234 (2014).
- Foley, D., et al. Curtain flow chromatography (‘the infinite diameter column’) with automated injection and high sample through-put: The results of an inter-laboratory study. Microchem. J. 110, 127-132 (2013).
