Curtain Flow Klumme: Optimering af effektivitet og følsomhed

Summary

Here, we present a protocol for the operation and optimization of Active Flow Technology (AFT) column in Curtain flow (CF) mode for enhanced separation performance.

Abstract

Active Flow Technology (AFT) is a form of column technology that increases the separation performance of a HPLC column through the use of a specially purpose built multiport end-fitting(s). Curtain Flow (CF) columns belong to the AFT suite of columns, specifically the CF column is designed so that the sample is injected into the radial central region of the bed and a curtain flow of mobile phase surrounding the injection of solute prevents the radial dispersion of the sample to the wall. The column functions as an ‘infinite diameter’ column. The purpose of the design is to overcome the radial heterogeneity of the column bed, and at the same time maximize the sample load into the radial central region of the column bed, which serves to increase detection sensitivity. The protocol described herein outlines the system and CF column set up and the tuning process for an optimized infinite diameter ‘virtual’ column.

Introduction

I de senere år kolonnen teknologi til High Performance Liquid Chromatography (HPLC) har avancerede kraftigt; peak kapacitet er steget betydeligt takket brugen af ​​mindre partikelstørrelser og mere effektive kerne shell partikler. Da separationer er generelt mere effektive, har en flow-effekt været en stigning i følsomhed, da toppe er nu skarpere og dermed højere ^1-8.

Ikke desto mindre, radial seng heterogenitet er stadig en begrænsende faktor i udførelsen af ​​alle kolonner, men dette er ikke en ny historie, da chromatographers har kendt i mange år. Række senge er heterogene i både den radiale retning ^9-12, og langs søjlen akse ^10,12-15. Væggen-effekt specielt er en vigtig bidragyder til tabet af adskillelse ydeevne ^7,16-18. Shalliker og Ritchie ⁷ nylig revideret aspekter af kolonne seng heterogenitet og dermed det behøver ikke være discussed her yderligere. Selv nok til at sige, at variationen i kolonne seng pakningstæthed og væggen virkninger føre til en forvridning af det opløste stof stik, således at båndene elueres gennem kolonnen i stik, der ligner delvist fyldte suppe skåle snarere end tynde flade massive skiver ^7, der er normalt afbildet i grundlæggende pædagogiske tekster. Når eksperimenter blev foretaget således, at det opløste stof migration gennem lejet kunne visualiseres plug profiler inde i søjlen var delvis hule og hale sektion af båndet er i vid udstrækning vægkomponent af prøven stik. Slutresultatet er, at det tager mange flere plader til at adskille disse "delvist hule 'propper, end det ville være påkrævet, hvis skiverne var fast og flad ^12,14,17. For at overvinde bandet udvide spørgsmål i forbindelse med væg effekter og variationen i radial pakning tæthed blev en ny form for kolonne teknologi kaldet Active Flow Technology (AFT) designet ^7,19. Formålet med dette motiv varat fjerne væg virkninger gennem den fysiske adskillelse af opløsningsmiddel eluerende langs væggen regionen, fra den af mobil fase eluering i den radiale midterområdet af kolonne ^19. Der er to hovedtyper af AFT søjler; Parallelle Segmenteret Flow (PSF) søjler og Curtain Flow (CF) kolonner ^7. Da denne protokol er rettet mod anvendelse og optimering af CF kolonner, PSF kolonner vil ikke blive yderligere diskuteret.

Curtain Flow (CF)

Curtain Flow (CF) søjle formater anvender agterenden-fittings på både indløbet og udløbet af søjlen. Agterenden-fittings består af en ringformet fritte placeret inde i en multiport fitting. Fritten består af tre dele: en porøs radial midterdel, der ligger på linie med den centrale port endefittingen, en porøs ydre del, som ligger på linie med den perifere port (e) af endefittingen, og en impermeabel ring, adskiller de to porøse dele forhindrer eventuelle cross-Flow mellem de radiale centrale og ydre områder af fritten ^19. Figur 1 illustrerer udformningen af den AFT fritte og Figur 2 illustrerer CF kolonne format. I denne driftstilstand (CF) prøven injiceres i den radiale centrale port indgangsfittingen, mens yderligere mobil fase indføres gennem den perifere port af indløbet til "gardin" migrationen af ​​opløste stoffer gennem det radiale midterområdet af kolonne. Derfor prøven kommer ind i sengen i den radiale midterområdet af søjlen med det ydre område af søjlen med mobilfase kun igennem den. Undersøgelser har vist, at en volumetrisk strømningshastighed forhold på omkring 40:60 (central: perifer port) til indløb endefitting af en 4,6 mm indre diameter (ID) søjle er optimal ^6,7,16. Den AFT udløb CF kolonnen tillader regulering af det centrale og perifere flow til deres relative del og kan varieres til næsten enhver ønsket ratio gennem pres management. Optimeringen af ​​et CF-søjle kan forbedre forskellige funktionelle aspekter af søjlen teknologi, såsom separationseffektiviteten eller detektion følsomhed betydeligt. På denne måde en "væg-mindre", "uendelig diameter" eller "virtuelle" kolonnen er etableret ^6,10,18,20. Formålet med CF kolonner er aktivt at styre migrationen af ​​prøven gennem søjlen for at forhindre prøven i at nå væggen region. Således er det opløste stof koncentration efter udgang til detektoren maksimeret, stigende følsomhed på omkring 2,5 gange større end den konventionelle søjleformat ved brug Ultraviolet (UV) påvisning ^16, og endnu større, når der anvendes massespektral detektion ^6.

CF kolonner er ideelt egnede til lave prøver koncentration, da detekteringsfølsomhed forøges. Yderligere, de er ideelle, når koblet til strømningshastighed begrænset detektorer, såsom massespektrometer (MS) ^6. en AFT-søjle i en 4,6 mm id format, for eksempel kan indstilles til at levere den samme mængde opløsningsmiddel til en detektor som en standard kolonne id format 2,1 mm, når den betjenes ved de samme lineære hastigheder, ved at justere spændende central flow til 21%. Ligeledes AFT kolonne kunne også være indstillet til at levere den samme mængde materiale op til en detektor som id kolonne 3,0 mm, ved at justere spændende central flow til 43%. Faktisk enhver "virtuelle" kolonneformat kunne produceres til at passe den analytiske krav ^6,18,22. Ved hjælp af disse er specielt konstrueret endelige fittings ved indløbet og udløbet sikrer, at en sand væg-mindre kolonne er etableret.

Der er to måder at oprette opløsningsmidlet leveringssystem til de centrale og perifere havne i fjorden:. Split-flow-system ⁶ og to pumpesystem ^6,7 Figur 3 illustrerer hver af disse CF-system sæt ups.

Split-flow-system

jegna split-flow-system (figur 3A) pumpens strømning fører til injektoren er opdelt pre-injektor anvendelse af en nul-dødvolumen T-stykke, hvor en strøm strøm af mobil fase er forbundet til injektoren, som derefter forbindes til central havn indløbsenden-montering af søjlen. Den anden strøm strøm af mobil fase ved-passerer injektoren og er forbundet med den perifere port på indløbet af søjlen. Under opdeling af strømmen, er gennemstrømningsstrømmen procentdel justeret til 40:60 (center: perifer) før linierne er forbundet til søjlen, dvs. fra injektoren til centrum og pumpe til perifere.

To pumpesystem

CF kolonne kræver to strømme ved indløbsenden-montering af søjlen. Afhængigt af typen af autosampleren / injektor af HPLC instrument, delt strømning oprettet muligvis ikke muligt, og så CF kan derefter opnås gennem 2 pumper (Figur 3B ²¹⁾. Hver pumpe er allokeret, og forbundet til enten den centrale eller perifere havn og strømningshastigheden indstilles til at repræsentere 40% af strømmen til central port og 60% for perifer port. For eksempel, hvis den samlede strømningshastighed er 1,0 ml min ^-1, er den centrale pumpegennemstrømningshastigheden sat til 0,4 ml ^min-1 og den perifere pumpen er sat til 0,6 ml ^min-1.

Valget af hvilken driftsform er i høj grad afhængig af HPLC instrumentering og kromatografisk driftsform. For eksempel i nogle autosamplere en trykændring mellem prøve fyldestilling og prøve injicere position kan forekomme afbryde delt strømning forholdet og dermed i dette tilfælde en dobbelt pumpe oprettet ville blive anbefalet til optimal CF ydeevne. Uanset den opløsningsmiddeltilførselssystem oprettet valgt til indløbet af CF kolonne, forbliver CF outlet optimering samme. Udløbet centrale havn CF kolonne er knyttet til Ultraviolet-synligt lys (UV-Vis) detektor med smallest volumen muligt slange for at minimere virkningerne af post-kolonne døde volumen. Da CF kolonner emulere smal-boring kolonner, døde volumen mellem masten og detektoren er skadelig for separationsydeevnen af ​​CF-søjle. Det er afgørende at sikre den mindste mængde af volumen af ​​slangen mellem den centrale port og UV-Vis detektor for at minimere virkningerne af døde volumen såsom band udvidelse, tab i effektivitet og følsomhed. Derfor er anvendelsen af ​​smalle borerør (0,1 mm id) rådes til let tillade tryk- justeringer uden at tilføje upassende dødvolumen. Tubing er ligeledes forbundet med den perifere havn og instrueret til spilde. Ved udløbet fra CF kolonnen, kan segmentering forholdet justeres til ethvert forhold, der passer til formålet med analytikeren. Når der anvendes en 4,6 mm id CF, for eksempel, er det ofte praktisk at indstille forhold som enten 43:57 eller 21:79 (centrum: perifer) at emulere en virtuel 3,0 mm id kolonne eller id kolonne 2,1 mm,respektfuldt. På den måde adskillelsen ydeevne er let bench-mærket. Segmenteringen ratio måles ved at veje mængden af ​​strømning kommer ud fra detektoren, som er forbundet til den centrale port og flow forlader periferitilslutningen over en periode tid. Den procentvise flow gennem hver port kan derefter bestemmes, og forholdene kan justeres ved at ændre længden af ​​slangen er fastgjort eller ved hjælp rør, der har en anden indre diameter (ID).

Denne video protokol beskriver drift og optimering procedurer et CF kolonne for øget kromatografisk ydeevne.

Protocol

Advarsel: Der henvises til sikkerhedsdatablade (MSDS) for alle materialer og reagenser før brug (dvs. MSDS for methanol). Sørg for brug af alle relevante sikkerhedspraksis ved håndtering opløsningsmidler og højtryksvæskekromatografi (HPLC) elueringsmiddel. Sikre passende anvendelse af tekniske kontroller af HPLC, analysevægt og detektor instrumentering, og sikre anvendelsen af ​​personlige værnemidler (sikkerhedsbriller, handsker, kittel, fuld længde bukser, og lukkede toe sko). <p class="jove_…

Representative Results

AFT søjler blev udviklet under anvendelse af en specialiseret fritte design (figur 1) i multiport kolonne endelige fittings til at overvinde søjlelejet heterogenitet og forbedre adskillelse ydeevne. En inter-laboratorium undersøgelse om adskillelse ydeevne CF kromatografisøjler (figur 2) blev udført med en dobbelt pumpesystem oprettet (figur 3B), som beskrevet i afsnit 3 i denne protokol 23. En tre-komponent testblanding …

Discussion

Denne undersøgelse omfattede inter-laboratorieanalyse af CF kromatografikolonner at teste den analytiske ydeevne med hensyn til effektivitet og følsomhed. CF kolonne blev oprettet med en dobbelt pumpesystem som beskrevet i afsnit »3. Dual pumpesystem oprettet »at opnå en strøm 40:60 (center: perifer) på indgangen til CF-søjle. Den 40:60 (center: perifer) strømning forhold blev opnået ved at indstille strømningshastigheden af ​​hver pumpe til værdien, der repræsenterer 40% og 60% af den samlede strømnin…

Materials

HPLC instrument
Additional Pump			Required if 2 pump CF system set up is to be used.
Curtain Flow HPLC column	Thermo Fisher Scientific	Not Defined	Soon to be commercialised
Methanol	Any brand		HPLC Grade
PEEK tubing	Any brand		Various lengths and i.d.
PEEK tube cutter	Any brand
Analytical Scale Balance	Any brand
Stop watch	Any brand
Eluent collection vessels	Any brand		1-2 mL Sample vials can be used as eluent collection vessels
T-piece	Any brand