הרמת מסך טור זרימה: אופטימיזציה של יעילות ורגישות
Summary
Here, we present a protocol for the operation and optimization of Active Flow Technology (AFT) column in Curtain flow (CF) mode for enhanced separation performance.
Abstract
Active Flow Technology (AFT) is a form of column technology that increases the separation performance of a HPLC column through the use of a specially purpose built multiport end-fitting(s). Curtain Flow (CF) columns belong to the AFT suite of columns, specifically the CF column is designed so that the sample is injected into the radial central region of the bed and a curtain flow of mobile phase surrounding the injection of solute prevents the radial dispersion of the sample to the wall. The column functions as an ‘infinite diameter’ column. The purpose of the design is to overcome the radial heterogeneity of the column bed, and at the same time maximize the sample load into the radial central region of the column bed, which serves to increase detection sensitivity. The protocol described herein outlines the system and CF column set up and the tuning process for an optimized infinite diameter ‘virtual’ column.
Introduction
בשנים האחרונות הטכנולוגיה טור כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים (HPLC) התקדמה מאוד; יכל שיא גדלו במידה ניכרת בעיקר הודות השימוש גדל של חלקיקים קטנים יותר חלקיקי פגז ליבה היעילים יותר. מאז הפרדות הן בדרך כלל יעילות יותר, זרימה על אפקט שהובילה לעלייה ברגישות מאז פסגות הן עכשיו חדות ומכאן גבוהות 1-8.
אף על פי כן, ההטרוגניות מיטת רדיאלי הוא עדיין גורם המגביל את הביצועים של כל העמודות, אבל זה לא סיפור חדש מאז משתמשי כרומטוגרפיה לדעת זה במשך שנים רבות. מיטות טור הם הטרוגניים בשני בכיוון הרדיאלי 9-12, ולאורך בעמודה ציר 10,12-15. The-אפקט הקיר במיוחד הוא תורם חשוב אובדן 7,16-18 ביצועי הפרדה. Shalliker ואת ריצ'י 7 נבדקו לאחרונה היבטים של ההטרוגניות מיטת עמודה ומכאן זה לא צריך להיות discusseד כאן עוד. למרות די לומר, כי וריאצית צפיפות אריזת מיטת עמודה והשפעות הקיר להוביל לעיוות של התקע המומס, כך להקות elute דרך עמודת תקעים דומות מולאו מרק חלקית קערות במקום דיסקים מוצקים שטוח דק 7 כי הם בדרך כלל מתואר בטקסטים הוראה בסיסית. כאשר ניסויים נערכו כך הגירה המומסת דרך המיטה יכולה להיות מדמיין את הפרופילים תקעו בתוך הטור היו בחלקם חלולים בסעיף העוקב של הלהקה הוא במידה רבה מרכיב הקיר של התקע המדגם. התוצאה הסופית היא שזה לוקח הרבה יותר צלחות להפריד אלה 'חלקית חלולים' תקעים מ יידרש אם הדיסקים היו מוצקים ושטוח 12,14,17. כדי להתגבר על להקת הרחבת נושאים הקשורים תופעות קיר ואת וריאצית צפיפות אריזה רדיאלי, צורה חדשה של טכנולוגית טור המכונית Active Flow Technology (AFT) תוכננה 7,19. מטרת העיצוב הזה הייתהכדי להסיר אפקטי קיר באמצעות ההפרדה הפיסית של משחררי ממס יחד באזור הקיר, ומאותו שלב נייד משחרר באזור המרכז הרדיאלי של העמודה 19. ישנם שני סוגים עיקריים של עמודות AFT; מקוטע זרימה במקביל (PSF) עמודות ושפל מסך (CF) עמודות 7. מאז פרוטוקול זה מיועד לשימוש ואופטימיזציה של עמודות CF, עמודות PSF לא יידונו נוספת.
הרמת מסך זרימה (CF)
תזרים הרמת מסך (CF) פורמטים טור לנצל סוף-אביזרי AFT בשני מפרצון ולשקע של הטור. סוף-אבזרי AFT מורכבים frit טבעתי הממוקם בתוך הולם multiport. Frit מורכב משלושה חלקים: חלק המרכזי רדיאלי נקבובי כי מיושר עם הנמל המרכזי של הסוף ההולם, חלק חיצוני נקבובי כי מיושר עם היציאה ההיקפית (ים) של הסוף ההולם וטבעת בלתי חדירה כי מפריד בין שני חלקים נקבוביים למנוע כל צלב-flow בין אזור המרכז החיצוני הרדיאלי של frit 19. איור 1 מדגים את העיצוב של frit AFT ואיור 2 מתאר את פורמט טור CF. במצב זה של מבצע (CF) המדגם מוזרק לתוך הנמל המרכזי הרדיאלי של כניסת הולם, תוך בשלב נייד נוסף הוא הציג דרך היציאה ההיקפית של הכניסה 'הווילון' נדידת המומסים דרך באזור המרכז הרדיאלי של טור. לפיכך המדגם נכנס למיטה באזור המרכז רדיאלי של הטור עם האזור החיצוני של הטור שיש שלב נייד רק עבר את זה. מחקרים הראו כי יחס ספיקה של כ 40:60 (מרכזי: יציאה היקפית) עבור כניסת הסוף ההולמת של טור 4.6 מ"מ הקוטר פנימי (ID) הוא 6,7,16 אופטימלי. שקע AFT של טור CF מאפשר התאמת הזרימה המרכזית ואת הפריפריה אל החלק היחסי שלהם יכול להיות מגוון כמעט לכל רטי רצויo באמצעות ניהול לחץ. אופטימיזציה של טור CF יכולה לשפר באופן משמעותי שונים היבטים פונקציונליים של טכנולוגית הטור, כגון יעילות הפרדה או רגישות זיהוי. באופן זה 'חסר-הקירות', 'בקוטר אינסופי "או" וירטואלי "טור מוקמת 6,10,18,20. מטרת עמודות CF היא לנהל את ההגירה של המדגם פעיל דרך העמודה כדי למנוע המדגם מלהגיע לאזור הקיר. לפיכך, הריכוז המומס עם יציאה אל הגלאי מוגדל, מגביר את הרגישות של כ 2.5 פעמים יותר מאשר הפורמט הקונבנציונלי הטור בעת שימוש אולטרה סגולה (UV) זיהוי 16, ואפילו יותר כאשר באמצעות זיהוי ספקטרלי המוני 6.
עמודות CF מתאימות בצורה אידיאלית עבור דגימות ריכוז נמוכות, מאז גילוי רגישות מוגברת. יתר על כן, הם אידיאליים כאשר מצמידים לזרום גלאי מוגבל שיעור, כמו ספקטרומטר מסה (MS) 6. האות Aטור FT במתכונת id 4.6 מ"מ, למשל יכול להיות מכוון כדי לספק את אותו נפח של ממס לגלאי כגיס בפורמט 2.1 מ"מ id רגיל כאשר פעל באותו מהירויות ליניארי, על ידי התאמת יציאה לזרם מרכזי ל -21%. כמו כן בעמודת AFT יכול גם להיות מכוונת כדי לספק אותו עומס נפח גלאי כגיס id 3.0 מ"מ, על ידי התאמת יציאה לזרם מרכזי ל -43%. למעשה בכל פורמט טור 'וירטואלי' יכול להיות מיוצר כדי להתאים את הדרישה אנליטיים 6,18,22. שימוש מקצה אבזרים אלה תוכננו במיוחד על המפרצון ולשקע מבטיח כי טור חסר-הקירות נכון היא הוקמה.
ישנן שתי דרכים להגדיר את מערכת המסירה ממסה ליציאות המרכזיות ואת הפריפריה של הכניסה:. מערכת זרימת פיצול 6 ושני 6,7 מערכת משאבת איור 3 ממחישים כל של עליות להגדיר מערכת אלה CF.
מערכת פיצול זרימה
אנימערכת מפוצלת זרימה נה (איור 3 א) את זרימת משאבת מוביל ההזרקה היא מזרק מראש פיצול באמצעות T-piece נפח אפס מת, שבו זרם זרם אחד השלב נייד מחובר ההזרקה, אשר מחוברת אז אל הנמל המרכזי של סוף-הולם מפרצון של הטור. נחל הזרם השני של שלב נייד על ידי-עובר מזרק והוא מחובר ליציאת הפריפריה על המפרצון של הטור. במהלך קריעת הזרימה, אחוז זרם התזרים מותאם 40:60 (מרכז: היקפי) לפני הקווים המחוברים בטור, כלומר, מן המזרק ל'מרכז לשאוב כדי היקפי.
מערכת המשאבה השנייה
עמודת CF דורשת שני זרמי זרימה ההולמת סוף כניסת הטור. בהתאם לסוג של autosampler / מזרק של מכשיר HPLC, מפוצל הזרימה להגדיר אינו אפשרי, ולכן CF אז יכול להיות מושג באמצעות 2 משאבות (איור 3 ב 21). משאבת מוקצה ומחוברת גם הנמל המרכזי או ציוד היקפי ואת קצב הזרימה מוגדר לייצג 40% של זרימה עבור נמל מרכזי ו -60% עבור יציאה היקפית. לדוגמא, אם קצב הזרימה הכולל הוא 1.0 מיליליטר דקות -1, את קצב זרימת משאבה המרכזי מוגדר 0.4 מיליליטר דקות -1 ואת המשאבה ההיקפית מוגדרת 0.6 מיליליטר דקות -1.
הבחירה של איזה מצב של המבצע היא תלויה במידה רבה על מכשור HPLC ומצב chromatographic של המבצע. לדוגמה בחלק autosamplers שינוי בלחץ בין מדגם עמדת עומס המדגם להזריק מיקום עשוי להתרחש שיבוש ביחס פיצול הזרימה וכך במקרה זה משאבה כפול להגדיר יהיה מומלץ עבור ביצועי CF אופטימליים. לא משנה את מערכת המסירה הממסה להגדיר שנבחרה עבור כניסת טור CF, אופטימיזציה לשקע CF נשארה זהה. הנמל המרכזי לשקע של הטור CF מצורף גלאי אולטרא סגול-גלוי (UV-Vis) עם smalפן נפח אפשרי של צינורות כדי למזער את ההשפעות של נפח מת שלאחר העמודה. מאז, עמודות CF לחקות בטורים צרים נישאים, נפח מת בין לשקע העמודה ואת הגלאים יש השלכות שלילי על הביצועים הפרדה בעמודת CF. זה קריטי כדי להבטיח את הכמות הקטנה ביותר של נפח של צינורות בין הנמל המרכזי ואת גלאי UV-Vis כדי למזער את ההשפעות של נפח מת כגון הרחבת להקה, אובדן יעיל ורגיש. לפיכך, השימוש של צינורות נישאים צרים (0.1 מ"מ id) מומלץ לאפשר התאמות לחץ בקלות מבלי להוסיף נפח מת הולם. Tubing מצורף גם ליציאה ההיקפית וביים לבזבז. עם היציאה של טור CF, יחס הפילוח יכול להיות מותאם לכל יחס שמתאים לצורך האנליסט. כאשר CF id 4.6 מ"מ משמש, למשל, היא לעתים קרובות נוח להגדיר יחס כמו גם 43:57 או 21:79 (מרכז: היקפי) לחקות טור id 'וירטואלי' 3.0 מ"מ או 2.1 מ"מ טור id,בכבוד. ככה ביצועי ההפרדה הוא ספסל מסומן בקלות. יחס הפילוח נמדד במשקל בסך של זרימת יציאה מהמגלה המחובר ליציאה המרכזית וזרימת יציאה לנמל הפריפריה על פני תקופת זמן. תזרים האחוז דרך כל יציאה אז יכול להיות נחוש היחסים יכולים להיות מותאם על ידי שינוי האורך של צינור מחובר או באמצעות צינורות בעל קוטר פנימי שונה (id).
פרוטוקול וידאו זה מפרט את נהלי התפעול ואופטימיזציה של טור CF לביצועי chromatographic משופר.
Protocol
Representative Results
Discussion
מחקר זה כלל בניתוח ומעבדת היתר של עמודות כרומטוגרפיה CF לבדוק את הביצועים אנליטי במונחים של יעילות ורגישה. העמודה CF הוקם עם מערכת שאיבה כפולה כמפורט בסעיף '3. מערכת משאבה כפולה להגדיר 'כדי להשיג יחס תזרים של 40:60 (מרכז: היקפי) על כניסת טור CF. 40:60 (מרכז: היקפי) יחס התזרים …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
One of the authors (DK) acknowledges the receipt of an Australian Postgraduate Award.
Materials
| HPLC instrument | |||
| Additional Pump | Required if 2 pump CF system set up is to be used. | ||
| Curtain Flow HPLC column | Thermo Fisher Scientific | Not Defined | Soon to be commercialised |
| Methanol | Any brand | HPLC Grade | |
| PEEK tubing | Any brand | Various lengths and i.d. | |
| PEEK tube cutter | Any brand | ||
| Analytical Scale Balance | Any brand | ||
| Stop watch | Any brand | ||
| Eluent collection vessels | Any brand | 1-2 mL Sample vials can be used as eluent collection vessels | |
| T-piece | Any brand |
References
- Camenzuli, M., et al. The use of parallel segmented outlet flow columns for enhanced mass spectral sensitivity at high chromatographic flow rates. Rapid Commun. Mass Sp. 26 (8), 943-949 (2012).
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. Enhanced separation performance using a new column technology: Parallel segmented outlet flow. J. Chromatogr. A. 1232, 47-51 (2012).
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Shalliker, R. A. Gradient elution chromatography with segmented parallel flow column technology: A study on 4.6mm analytical scale columns. J. Chromatogr. A. 1270, 204-211 (2012).
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Shalliker, R. A. Improving HPLC separation performance using parallel segmented flow chromatography. Microchem. J. 111, 3-7 (2013).
- Camenzuli, M., et al. Parallel segmented outlet flow high performance liquid chromatography with multiplexed detection. Anal. Chim. Acta. 803, 154-159 (2013).
- Kocic, D., et al. High through-put and highly sensitive liquid chromatography-tandem mass spectrometry separations of essential amino acids using active flow technology chromatography columns. J. Chromatogr. A. 1305, 102-108 (2013).
- Shalliker, R. A., Ritchie, H. Segmented flow and curtain flow chromatography: Overcoming the wall effect and heterogeneous bed structures. J. Chromatogr. A. 1335, 122-135 (2014).
- Shellie, R., Haddad, P. Comprehensive two-dimensional liquid chromatography. Anal. Bioanal. Chem. 386 (3), 405-415 (2006).
- Abia, J. A., Mriziq, K. S., Guiochon, G. A. Radial heterogeneity of some analytical columns used in high-performance liquid chromatography. J. Chromatogr. A. 1216 (15), 3185-3191 (2009).
- Knox, J. H., Laird, G. R., Raven, P. A. Interaction of radial and axial dispersion in liquid chromatography in relation to the "infinite diameter effect". J. Chromatogr. A. 122, 129-145 (1976).
- Miyabe, K., Guiochon, G. Estimation of the column radial heterogeneity from an analysis of the characteristics of tailing peaks in linear chromatography. J. Chromatogr. A. 830 (1), 29-39 (1999).
- Shalliker, R. A., Scott Broyles, B., Guiochon, G. Axial and radial diffusion coefficients in a liquid chromatography column and bed heterogeneity. J. Chromatogr. A. 994 (1-2), 1-12 (2003).
- Gritti, F., Guiochon, G. Effects of the thermal heterogeneity of the column on chromatographic results. J. Chromatogr. A. 1131 (1-2), 151-165 (2006).
- Shalliker, R. A., Wong, V., Broyles, B. S., Guiochon, G. Visualization of bed compression in an axial compression liquid chromatography column. J. Chromatogr. A. 977 (2), 213-223 (2002).
- Tallarek, U., Albert, K., Bayer, E., Guiochon, G. Measurement of transverse and axial apparent dispersion coefficients in packed beds. AICHE J. 42 (11), 3041-3054 (1996).
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. Active flow management in preparative chromatographic separations: A preliminary investigation into enhanced separation using a curtain flow inlet fitting and segmented flow outlet. J. Sep. Sci. 35 (3), 410-415 (2012).
- Shalliker, R. A., Broyles, B. S., Guiochon, G. Physical evidence of two wall effects in liquid chromatography. J. Chromatogr. A. 888 (1-2), 1-12 (2000).
- Shalliker, R. A., Camenzuli, M., Pereira, L., Ritchie, H. J. Parallel segmented flow chromatography columns: Conventional analytical scale column formats presenting as a ‘virtual’ narrow bore column. J. Chromatogr. A. 1262, 64-69 (2012).
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. The design of a new concept chromatography column. Analyst. 136 (24), 5127-5130 (2011).
- Foley, D., et al. Precision and Reliability: an Intercontinental Study of Curtain Flow Chromatography. Thermo Scientific. , (2013).
- Pravadali-Cekic, S. Multidimensional Approaches for the Analysis of Complex Samples using HPLC. University of Western Sydney. , (2014).
- Soliven, A., et al. Improving the performance of narrow-bore HPLC columns using active flow technology. Microchem. J. 116, 230-234 (2014).
- Foley, D., et al. Curtain flow chromatography (‘the infinite diameter column’) with automated injection and high sample through-put: The results of an inter-laboratory study. Microchem. J. 110, 127-132 (2013).
