पर्दे के प्रवाह स्तंभ: क्षमता और संवेदनशीलता के अनुकूलन
Summary
Here, we present a protocol for the operation and optimization of Active Flow Technology (AFT) column in Curtain flow (CF) mode for enhanced separation performance.
Abstract
Active Flow Technology (AFT) is a form of column technology that increases the separation performance of a HPLC column through the use of a specially purpose built multiport end-fitting(s). Curtain Flow (CF) columns belong to the AFT suite of columns, specifically the CF column is designed so that the sample is injected into the radial central region of the bed and a curtain flow of mobile phase surrounding the injection of solute prevents the radial dispersion of the sample to the wall. The column functions as an ‘infinite diameter’ column. The purpose of the design is to overcome the radial heterogeneity of the column bed, and at the same time maximize the sample load into the radial central region of the column bed, which serves to increase detection sensitivity. The protocol described herein outlines the system and CF column set up and the tuning process for an optimized infinite diameter ‘virtual’ column.
Introduction
हाल के वर्षों में उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (एचपीएलसी) के लिए स्तंभ तकनीक बहुत उन्नत है; शिखर क्षमता काफी हद तक छोटे कण आकार के उपयोग और अधिक कुशल कोर खोल कणों को काफी धन्यवाद वृद्धि हुई है। चूंकि विभाजन आम तौर पर अधिक कुशल हैं, एक प्रवाह पर प्रभाव के प्रति संवेदनशीलता में वृद्धि की गई है के बाद से अब चोटियों तेज और इसलिए लम्बे 1-8 कर रहे हैं।
फिर भी, रेडियल बिस्तर विविधता अभी भी सभी स्तंभों के प्रदर्शन में एक सीमित कारक है, लेकिन यह एक नई कहानी के बाद से chromatographers कई वर्षों के लिए जाना जाता है नहीं है। कॉलम बेड दोनों रेडियल दिशा 9-12 में विषम हैं, और 10,12-15 अक्ष कॉलम के साथ। दीवार पर प्रभाव विशेष रूप से जुदाई प्रदर्शन 7,16-18 के नुकसान के लिए एक महत्वपूर्ण योगदान है। Shalliker और रिची 7 हाल ही में स्तंभ बिस्तर विविधता के पहलुओं की समीक्षा की है और इसलिए इस discusse होने की जरूरत नहींयहाँ आगे घ। हालांकि इतना ही कहना है, कि स्तंभ बिस्तर पैकिंग घनत्व में भिन्नता और दीवार प्रभाव घुला हुआ पदार्थ प्लग की एक विकृति है, जैसे कि बैंड प्लग कि आंशिक रूप से सूप भरा सदृश में कॉलम के माध्यम से elute करने के लिए नेतृत्व के कटोरे बल्कि पतली फ्लैट ठोस डिस्क 7 रहे हैं कि अधिक से आम तौर पर बुनियादी शिक्षण ग्रंथों में दर्शाया। जब प्रयोगों में इस तरह के कार्य शुरू किया गया है कि बिस्तर के माध्यम से घुला हुआ पलायन देखे जा सकते हैं स्तंभ के अंदर प्लग प्रोफाइल आंशिक रूप से खोखला कर रहे थे और बैंड का पीछा खंड काफी हद तक नमूना प्लग की दीवार घटक है। अंतिम परिणाम यह है कि इन 'आंशिक रूप से खोखला' प्लग से आवश्यक होगा यदि डिस्क ठोस और फ्लैट 12,14,17 थे अलग करने के लिए कई और अधिक प्लेटों लेता है। बैंड दीवार प्रभाव और रेडियल पैकिंग घनत्व में परिवर्तन के साथ जुड़े मुद्दों को व्यापक बनाने पर काबू पाने के लिए, के रूप में चर्चित प्रवाह प्रौद्योगिकी (एएफटी) में जाना जाता स्तंभ प्रौद्योगिकी का एक नया रूप 7,19 डिजाइन किया गया था। इस डिजाइन के उद्देश्य थादीवार क्षेत्र के साथ विलायक Eluting के भौतिक जुदाई के माध्यम से दीवार प्रभाव को दूर करने के लिए, स्तंभ 19 के रेडियल मध्य क्षेत्र में एल्यूटिंग मोबाइल चरण के उस से। वहाँ पिछाड़ी स्तंभों की दो मुख्य प्रकार हैं; समानांतर खंडों फ्लो (पीएसएफ) कॉलम और पर्दे के प्रवाह (सीएफ) कॉलम 7। चूंकि इस प्रोटोकॉल का उपयोग और CF कॉलम के अनुकूलन के उद्देश्य से है, पीएसएफ कॉलम आगे चर्चा नहीं की जाएगी।
पर्दे के प्रवाह (सीएफ)
पर्दे के प्रवाह (सीएफ) स्तंभ प्रारूपों दोनों इनलेट और स्तंभ की दुकान पर पिछाड़ी अंत फिटिंग का उपयोग। पिछाड़ी अंत फिटिंग एक कुंडलाकार एक मल्टीपोर्ट फिटिंग के अंदर स्थित मिलाना से मिलकर बनता है। मिलाना तीन भागों से बना है: एक झरझरा रेडियल मध्य भाग कि उपयुक्त अंत के केंद्रीय बंदरगाह, एक झरझरा बाहरी भाग कि अंत फिटिंग के परिधीय बंदरगाह (एस) के साथ गठबंधन किया है, और एक अभेद्य की अंगूठी के साथ गठबंधन किया है कि दो झरझरा किसी भी पार रोकने भागों को अलग करती हैमिलाना 19 के रेडियल केंद्रीय और बाहरी क्षेत्रों के बीच -flow। चित्रा 1 दिखाता पिछाड़ी मिलाना के डिजाइन और चित्रा 2 सीएफ स्तंभ प्रारूप को दिखाता है। ऑपरेशन के इस मोड (सीएफ) में नमूना, इनलेट फिटिंग के रेडियल केंद्रीय पोर्ट में इंजेक्ट किया जाता है whilst अतिरिक्त मोबाइल चरण के रेडियल मध्य क्षेत्र के माध्यम से 'पर्दा' को विलेय के प्रवास के प्रवेश के परिधीय बंदरगाह के माध्यम से पेश किया है स्तंभ। इसलिए नमूना स्तंभ मोबाइल चरण केवल यह माध्यम से पारित होने के बाहरी क्षेत्र के साथ स्तंभ के रेडियल मध्य क्षेत्र में बिस्तर में प्रवेश करती है। अध्ययनों से पता चला है कि चारों ओर 40:60 का एक बड़ा प्रवाह दर अनुपात (Central: परिधीय बंदरगाह) इनलेट एक 4.6 मिमी आंतरिक व्यास (आईडी) कॉलम के अंत फिटिंग के लिए इष्टतम 6,7,16 है। सीएफ स्तंभ के पीछे आउटलेट उनके रिश्तेदार भाग के लिए केंद्रीय और परिधीय प्रवाह के समायोजन की अनुमति देता है और लगभग किसी भी वांछित रति को अलग किया जा सकताओ दबाव प्रबंधन के माध्यम से। एक CF स्तंभ के अनुकूलन काफी ऐसे जुदाई दक्षता या संवेदनशीलता का पता लगाने के रूप में स्तंभ प्रौद्योगिकी के विभिन्न कार्यात्मक पहलुओं में सुधार कर सकते हैं। इस तरीके में एक 'दीवार-कम', 'अनंत व्यास' या 'आभासी' कॉलम 6,10,18,20 की स्थापना की है। सीएफ कॉलम के प्रयोजन के लिए सक्रिय रूप से दीवार क्षेत्र तक पहुँचने से रोकने के लिए नमूना स्तंभ के माध्यम से नमूना के पलायन का प्रबंधन है। इस प्रकार, डिटेक्टर को बाहर निकलने पर घुला हुआ पदार्थ एकाग्रता अधिकतम है, पारंपरिक स्तंभ प्रारूप की तुलना में लगभग 2.5 गुना अधिक की संवेदनशीलता में वृद्धि का उपयोग करते समय पराबैंगनी (यूवी) का पता लगाने के लिए 16, और यहां तक कि बड़े पैमाने पर वर्णक्रम का पता लगाने 6 का उपयोग करते समय अधिक से अधिक।
सीएफ कॉलम आदर्श रूप में, कम एकाग्रता के नमूने के लिए अनुकूल हैं क्योंकि संवेदनशीलता का पता लगाने में वृद्धि हुई है। इसके अलावा, वे आदर्श जब प्रवाह करने के लिए इस तरह के मास स्पेक्ट्रोमीटर (एमएस) के रूप में 6 दर सीमित डिटेक्टरों, मिलकर कर रहे हैं। एक एकएक 4.6 मिमी आईडी प्रारूप में एफटी स्तंभ, उदाहरण के लिए जब एक ही रेखीय वेग पर संचालित, 21% करने के लिए केंद्रीय प्रवाह बाहर निकलने का समायोजन करके एक मानक 2.1 मिमी आईडी प्रारूप स्तंभ के रूप में एक डिटेक्टर के लिए विलायक का एक ही मात्रा देने के लिए देखते जा सकता है। इसी तरह पिछाड़ी स्तंभ भी, एक 3.0 मिमी आईडी स्तंभ के रूप में एक डिटेक्टर के लिए एक ही मात्रा लोड वितरित करने के लिए 43% करने के लिए केंद्रीय प्रवाह बाहर निकलने का समायोजन करके देखते जा सकता है। वास्तव में किसी भी 'आभासी' कॉलम प्रारूप विश्लेषणात्मक आवश्यकता 6,18,22 सूट करने के लिए उत्पादन किया जा सकता है। प्रवेश पर इन विशेष रूप से डिजाइन अंत फिटिंग का उपयोग और आउटलेट सुनिश्चित करता है कि एक सच्चे दीवार-कम स्तंभ स्थापित है।
इसमें प्रवेश के मध्य और परिधीय बंदरगाहों के लिए विलायक वितरण प्रणाली स्थापित करने के लिए दो तरीके हैं:। विभाजित प्रवाह प्रणाली 6 और दो पंप प्रणाली 6.7 चित्रा 3 इन सीएफ सिस्टम सेट अप के प्रत्येक दिखाता है।
विभाजन प्रवाह प्रणाली
मैंna विभाजन प्रवाह प्रणाली (चित्रा 3) पंप प्रवाह इंजेक्टर के लिए अग्रणी विभाजन पूर्व इंजेक्टर एक शून्य मृत मात्रा टी टुकड़ा है, जहां मोबाइल चरण की एक धारा का प्रवाह लगानेवाला, जो तब से जुड़ा है से जुड़ा है का उपयोग कर रहा है स्तंभ के इनलेट अंत फिटिंग के केंद्रीय बंदरगाह। मोबाइल चरण के दूसरे प्रवाह धारा इंजेक्टर द्वारा गुजरता है और स्तंभ के प्रवेश पर परिधीय बंदरगाह से जुड़ा है। केंद्र और परिधीय को पंप करने के लिए, इससे पहले कि लाइनों के स्तंभ से जुड़े हैं, यानी इंजेक्टर से: प्रवाह के बंटवारे के दौरान, प्रवाह धारा प्रतिशत 40:60 (परिधीय सेंटर) के लिए निकाला जाता है।
दो पंप प्रणाली
सीएफ स्तंभ स्तंभ के इनलेट अंत फिटिंग में दो प्रवाह धाराओं की आवश्यकता है। एचपीएलसी साधन, विभाजन के प्रवाह की स्थापना की autosampler / इंजेक्टर के प्रकार पर निर्भर करता है कि संभव नहीं हो सकता है, और इसलिए सीएफ तो 2 पंप (चित्रा 3 बी 21) के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता। प्रत्येक पंप आवंटित की है और या तो केंद्रीय या परिधीय बंदरगाह और प्रवाह की दर केंद्रीय बंदरगाह के लिए प्रवाह का 40% और परिधीय बंदरगाह के लिए 60% का प्रतिनिधित्व करने के लिए सेट कर दिया जाता से जुड़ा है। उदाहरण के लिए, यदि कुल प्रवाह की दर 1.0 मिलीलीटर मिनट -1 है, केंद्रीय पंप प्रवाह की दर 0.4 मिलीलीटर मिनट के लिए सेट कर दिया जाता -1 और परिधीय पंप 0.6 मिलीलीटर मिनट -1 के लिए निर्धारित है।
आपरेशन के जो विधा का चुनाव काफी हद तक एचपीएलसी इंस्ट्रूमेंटेशन और ऑपरेशन के chromatographic मोड पर निर्भर है। उदाहरण के कुछ autosamplers में नमूना लोड की स्थिति और नमूना के बीच दबाव में एक परिवर्तन इंजेक्षन स्थिति विभाजन प्रवाह अनुपात में खलल न डालें होने पर हो सकती है और इस तरह इस मामले में एक दोहरी पंप की स्थापना इष्टतम सीएफ प्रदर्शन के लिए सिफारिश की जाएगी लिए। की स्थापना की विलायक वितरण प्रणाली सीएफ स्तंभ के प्रवेश के लिए चुना है के बावजूद, सीएफ आउटलेट अनुकूलन ही रहता है। सीएफ स्तंभ के आउटलेट केंद्रीय बंदरगाह smal के साथ पराबैंगनी-दृश्य (यूवी विज़) डिटेक्टर से जुड़ा हुआ हैमात्रा ट्यूबिंग के संभावित ऐसा न हो कि बाद के स्तंभ मृत मात्रा के प्रभाव को कम करने के लिए। चूंकि, सीएफ कॉलम संकीर्ण बोर स्तंभों का अनुकरण, स्तंभ आउटलेट और डिटेक्टर के बीच मृत मात्रा सीएफ स्तंभ की जुदाई प्रदर्शन के लिए हानिकारक है। यह केंद्रीय बंदरगाह और यूवी विज़ डिटेक्टर इस तरह के बैंड विस्तार, कार्यकुशलता और संवेदनशीलता में नुकसान के रूप में मृत मात्रा के प्रभाव को कम करने के लिए बीच ट्यूबिंग की मात्रा की छोटी राशि सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है। इसलिए, संकीर्ण बोर ट्यूबिंग (0.1 मिमी आईडी) के उपयोग में आसानी से अनुचित मृत मात्रा जोड़ने के बिना दबाव समायोजन की अनुमति देने की सलाह दी है। ट्यूबिंग भी परिधीय बंदरगाह से जुड़ी है और बर्बाद करने के लिए निर्देशित किया गया है। सीएफ स्तंभ की दुकान पर, विभाजन अनुपात किसी भी अनुपात है कि विश्लेषक के उद्देश्य से फिट बैठता है समायोजित किया जा सकता है। जब एक 4.6 मिमी आईडी सीएफ प्रयोग किया जाता है, उदाहरण के लिए, यह अक्सर सुविधाजनक या तो 43:57 या 21:79 (केंद्र: परिधीय) के रूप में अनुपात निर्धारित करने के लिए एक 'आभासी' 3.0 मिमी आईडी स्तंभ या 2.1 मिमी आईडी स्तंभ का अनुकरण करने के लिए,सम्मान से। यही कारण है कि जिस तरह से जुदाई प्रदर्शन आसानी से बेंच में चिह्नित है। विभाजन अनुपात प्रवाह डिटेक्टर कि केंद्रीय बंदरगाह से जुड़ा है और एक अवधि के समय के साथ परिधीय बंदरगाह बाहर निकलने प्रवाह है से बाहर निकलने की राशि वजन द्वारा मापा जाता है। प्रत्येक बंदरगाह के माध्यम से प्रवाह प्रतिशत तो निर्धारित किया जा सकता और अनुपात ट्यूबिंग संलग्न की लंबाई में फेरबदल या ट्यूबिंग एक अलग आंतरिक व्यास (आईडी) का उपयोग कर समायोजित किया जा सकता है।
इस वीडियो प्रोटोकॉल का विवरण बढ़ाया chromatographic प्रदर्शन के लिए एक CF स्तंभ के संचालन और अनुकूलन प्रक्रियाओं।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस अध्ययन में दक्षता और संवेदनशीलता के मामले में विश्लेषणात्मक प्रदर्शन का परीक्षण करने सीएफ क्रोमैटोग्राफी स्तंभों की अंतर-प्रयोगशाला विश्लेषण शामिल किया गया। अनुभाग में '3 वर्णित के रूप में सीए?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
One of the authors (DK) acknowledges the receipt of an Australian Postgraduate Award.
Materials
| HPLC instrument | |||
| Additional Pump | Required if 2 pump CF system set up is to be used. | ||
| Curtain Flow HPLC column | Thermo Fisher Scientific | Not Defined | Soon to be commercialised |
| Methanol | Any brand | HPLC Grade | |
| PEEK tubing | Any brand | Various lengths and i.d. | |
| PEEK tube cutter | Any brand | ||
| Analytical Scale Balance | Any brand | ||
| Stop watch | Any brand | ||
| Eluent collection vessels | Any brand | 1-2 mL Sample vials can be used as eluent collection vessels | |
| T-piece | Any brand |
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