Here, we present a protocol for the operation and optimization of Active Flow Technology (AFT) column in Curtain flow (CF) mode for enhanced separation performance.
Active Flow Technology (AFT) is a form of column technology that increases the separation performance of a HPLC column through the use of a specially purpose built multiport end-fitting(s). Curtain Flow (CF) columns belong to the AFT suite of columns, specifically the CF column is designed so that the sample is injected into the radial central region of the bed and a curtain flow of mobile phase surrounding the injection of solute prevents the radial dispersion of the sample to the wall. The column functions as an ‘infinite diameter’ column. The purpose of the design is to overcome the radial heterogeneity of the column bed, and at the same time maximize the sample load into the radial central region of the column bed, which serves to increase detection sensitivity. The protocol described herein outlines the system and CF column set up and the tuning process for an optimized infinite diameter ‘virtual’ column.
近年、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)用カラム技術が大幅に進歩しています。ピーク容量がかなり大きくより小さい粒径、より効率的なコアシェル粒子の使用のおかげで増加しています。分離は一般的に、より効率的であるため、ピークが今よりシャープと1-8したがって、背が高いので、フローへの影響は感度の増加となっています。
それにもかかわらず、ラジアルベッドの不均一性は、まだすべてのカラムの性能の制限因子であるが、これはクロマトグラファーは、長年のためにこれを知っているので、新しい話ではないです。カラムベッドは、半径方向9-12、および列軸10,12-15に沿って両方に不均質です。壁効果は、特に分離性能の7,16-18の損失に重要な貢献です。 Shallikerとリッチー7は最近、カラム床の不均一性の側面を見直し、したがって、これはdiscusseである必要はありませんさらにここ日間。言えば十分もののカラムベッドの変動充填密度と壁の効果は溶質プラグの歪みにつながることを、バンドが部分的に充填されたスープに似ているプラグにカラムを通って溶出するようにしていることではなく、薄い平らな固体のディスクよりも7ボウル通常、基本的な教育の教科書に示されています。実験は、床を通る溶質の移行がカラム内部にプラグプロファイルを可視化することができることを、このような実施された場合には、部分的に中空であり、バンドのテーリング部分は、主にサンプルプラグの壁成分です。最終結果は、それがディスクが固体と12,14,17横ばいであった場合に必要とされるよりも、これらの「部分的に中空」プラグを分離するために、より多くのプレートがかかることです。壁効果とラジアル充填密度の変動に関連したバンドの広がりの問題を克服するために、アクティブ・フロー・テクノロジー(AFT)として知られているカラム技術の新しいフォームは7,19を設計しました。この設計の目的としましたコラム19の径方向中央領域に溶出する移動相のことから、壁の領域に沿って、溶出溶媒の物理的分離を介して壁の影響を除去します。 AFT列の2つの主要なタイプがあります。パラレル・セグメント化フロー(PSF)の列とカーテンフロー(CF)の列7。このプロトコルは、CFカラムの使用および最適化を目的としているので、PSFの列はさらに説明しません。
カーテンフロー(CF)
カーテンフロー(CF)カラム形式入口とカラム出口の両方でAFTエンド金具を利用しています。 AFTエンドフィッティングはマルチ金具の内側に位置する環状フリットで構成されています。継手端部の中央のポートと位置合わせされる多孔半径方向中央部、端部取付具の周辺ポート(複数可)と整列している多孔質の外側部分、及び不透過性リング:フリットは、3つの部分から構成され任意のクロスを防ぐ2の多孔質部分を分離フリット19の径方向の中央と外側の領域の間-flow。 図1は、AFTフリットの設計を示 し、 図2は、CFカラムフォーマットを示しています。追加の移動相は、半径方向中心領域を通って溶質の移行「カーテン」の入口の周辺ポートを介して導入されている間、この動作モード(CF)において、試料は、入口継手の半径方向の中央のポートに注入されますカラム。したがって、サンプルは、それを通過した移動相を持つカラムの外側領域とコラムの径方向中央領域におけるベッドに入ります。内径4.6mm(ID)の入口端部フィッティングのために列が最適6,7,16である:(ペリフェラルポート中央)の研究は、約40:60の体積流量比が示されています。 CF列のAFT出口は、それらの相対的な部分に中枢および末梢流れの調整を可能にし、ほとんど任意の所望RATIに変えることができます圧力管理を通じてO。 CF列の最適化が著しく、このような分離効率や検出感度などのカラム技術の様々な機能面を、向上させることができます。このように「壁のない'、'無限直径」または「仮想」列には、6,10,18,20を確立します。 CF列の目的は、積極的に壁領域に到達するサンプルを防止するために、カラムを通って試料の移動を管理することです。したがって、検出器の終了時に溶質濃度は、紫外線(UV)検出16、および質量スペクトル検出6を使用する場合に一層を使用する場合、従来のカラム形式よりも約2.5倍の感度を増加させる、最大化されます。
検出感度が増加するので、CFカラムは理想的には、低濃度のサンプルに適しています。このような質量分析計(MS)6のような速度制限された検出器を、流れるように接続されたときにまた、彼らは理想的です。 A同じ線速度で運転したときに、例えば4.6ミリメートルID形式でFTカラムは、21%の中央流を出る調整することにより、標準内径2.1 mmの形式の列として検出器に溶媒の同じ量を送達するように調整することができます。同様に、AFT列には、43%の中央流を出る調整することにより、3.0ミリメートルのidカラムとして検出器に同じボリュームの負荷を提供するように調整することができました。実際には任意の「仮想」列形式は、分析要件6,18,22に合わせて製造することができました。入口と出口でこれらの特別に設計されたエンドフィッティングを使用すると、真の壁のない列が確立されることを保証します。
入口の中枢および末梢ポートへの溶媒配送システム設定には2通りの方法があります。スプリットフローシステム6と2ポンプシステムの6,7 3は 、これらのCFシステムのセットアップのそれぞれを示しています。
スプリットフローシステム
私NA分流装置( 図3A)、インジェクタに導くポンプ流量は、移動相のフローストリームは、その後に接続されている注射器に接続され、ゼロデッドボリュームTピースを使用して分割前のインジェクタでありますカラムの入口端部フィッティングの中央ポート。移動相の第二の流れストリームインジェクタによっては、通過し、カラムの入口の周辺ポートに接続されています。中央および周辺にポンピングするインジェクタから、行が列に接続される前、 すなわち :流れの分裂の間、フローストリームの割合は、40:60(周辺中心)に調整されます。
二つのポンプシステム
CFの列は、列の入口エンドフィッティングに2つの流れの流れを必要とします。 HPLC装置のオートサンプラー/インジェクタの種類に応じて、設定スプリットフローを実現できない可能性があり、そのためCFを2ポンプ( 図3B 21)を介して達成することができます。各ポンプが割り当てられ、中枢または末梢ポート流量が中央ポートの流れの40%と周辺ポートの60%を表すように設定されているいずれかに接続されています。総流量1.0 mlの分-1である場合、例えば、中央のポンプ流量0.4 mlの分に設定されて-1と周辺ポンプ0.6 mlの分-1に設定されています。
動作モードの選択は、HPLCの計装および動作のクロマトグラフモードに大きく依存しています。例えば、いくつかのオートサンプラにサンプル負荷位置と試料との間の圧力の変化は、位置が設定デュアルポンプを分流比を中断するので、この場合に発生する可能性があります注入最適なCFのパフォーマンスのために推奨されることになります。かかわらず、CFのカラムの入口のために選択された設定溶剤送達システムの、CF出口最適化は同じまま。 CFのカラムの出口中央のポートはSmaIで紫外可視(UV-Vis)で検出器に取り付けられています。ポストカラムデッドボリュームの影響を最小限にするためにチューブの容積可能LEST。 、CF列が狭いボアカラムをエミュレートするので、カラム出口と検出器との間のデッドボリュームはCFカラムの分離性能に有害です。このようなバンドの広がり、効率及び感度の損失として、デッドボリュームの影響を最小限にするために、中央ポートとの間の配管の容積の最小量と紫外可視検出器を確実にするために重要です。そのため、小口径チューブ(0.1ミリメートルのID)の使用が容易に不適切なデッドボリュームを追加することなく、圧力調整を可能にすることをお勧めします。チューブは、周辺ポートに接続し、廃棄するように指示されます。 CFカラムの出口の際、分割比は、アナリストの目的に合った任意の比率に調整することができます。内径4.6mmのCFを使用した場合、例えば、43:57または21:79(中央周辺)のいずれかとの比率を設定することがしばしば便利である「仮想」予約3.0つミリメートルIDカラム2.1ミリメートルid列をエミュレートします、謹んで。その方法は、分離性能を容易にベンチマーキングされています。分割比は、中央のポートに接続された期間の時間をかけて周辺ポートを出るフローである検出器から出る流量を計量することによって測定されます。各ポートを介して百分率流量が決定することができ、比は、添付のチューブの長さを変更すること、または異なる内径(ID)を有する管を使用して調整することができます。
このビデオプロトコルは、強化されたクロマトグラフィー性能のためのCF列の操作および最適化手順を詳しく説明します。
この研究では、効率性と感度の点で分析性能をテストするためにCFクロマトグラフィーカラムの間の実験室分析を含みました。 3」のセクションで説明したように、CF列は、デュアルポンプシステムで設定されました。 CFのカラムの入口に:デュアルポンプシステムは40:60(周辺中央)の流量比を達成するために」を設置しました。 40:60(中央周辺)流量比は、それぞれ、40%及び総流量の60%?…
The authors have nothing to disclose.
One of the authors (DK) acknowledges the receipt of an Australian Postgraduate Award.
HPLC instrument | |||
Additional Pump | Required if 2 pump CF system set up is to be used. | ||
Curtain Flow HPLC column | Thermo Fisher Scientific | Not Defined | Soon to be commercialised |
Methanol | Any brand | HPLC Grade | |
PEEK tubing | Any brand | Various lengths and i.d. | |
PEEK tube cutter | Any brand | ||
Analytical Scale Balance | Any brand | ||
Stop watch | Any brand | ||
Eluent collection vessels | Any brand | 1-2 mL Sample vials can be used as eluent collection vessels | |
T-piece | Any brand |