흐름 열 커튼 : 효율성과 감도의 최적화

Summary

Here, we present a protocol for the operation and optimization of Active Flow Technology (AFT) column in Curtain flow (CF) mode for enhanced separation performance.

Abstract

Active Flow Technology (AFT) is a form of column technology that increases the separation performance of a HPLC column through the use of a specially purpose built multiport end-fitting(s). Curtain Flow (CF) columns belong to the AFT suite of columns, specifically the CF column is designed so that the sample is injected into the radial central region of the bed and a curtain flow of mobile phase surrounding the injection of solute prevents the radial dispersion of the sample to the wall. The column functions as an ‘infinite diameter’ column. The purpose of the design is to overcome the radial heterogeneity of the column bed, and at the same time maximize the sample load into the radial central region of the column bed, which serves to increase detection sensitivity. The protocol described herein outlines the system and CF column set up and the tuning process for an optimized infinite diameter ‘virtual’ column.

Introduction

최근에는 고속 액체 크로마토 그래피 (HPLC) 컬럼을위한 기술이 크게 발전하고있다; 최대 용량은 주로 작은 입자 크기를 사용하고,보다 효율적으로 코어 쉘 입자 상당히 확실히 증가하고있다. 분리는 일반적으로 더 효율적이기 때문에 피크가 지금 선명하고 ^1-8 따라서 키가 있기 때문에, 플로우에 대한 효과는 감도가 증가하고있다.

그럼에도 불구하고, 방사 층 얼룩이 모든 컬럼의 성능에 제한 요소가 여전히 있지만, 이것은 크로마토 그래피 수년이 알려진 이후 새로운 스토리 아니다. 열 침대 반경 방향 ^9-12 모두에서 이질적이며, ^10,12-15 축 열을 따라. 벽 효과, 특히 분리 성능 ^7,16-18 손실에 중요한 공헌자이다. Shalliker와 리치 ⁷ 최근에 열 침대 이질성의 측면을 검토하고, 따라서이 discusse 할 필요는 없다D 여기에 추가. 충분할 말하고 있지만, 열 베드 패킹 밀도의 변동과 벽 효과 밴드 부분적 스프 충전과 유사한 플러그의 컬럼을 통해 용출되도록 용질 플러그의 왜곡을 초래할 오히려있는 얇은 평평한 고체 디스크 ^7보다 그릇 일반적으로 기본 교육 텍스트에 묘사. 실험 베드를 통하여 용질 이동이 가시화 될 수 있도록 수행 될 때 열 내부 플러그 프로필 부분적 중공이었고 밴드의 테일링 부는 주로 샘플 플러그의 벽 컴포넌트이다. 최종 결과는 디스크가 고체 ^12,14,17 평면 인 경우 요구되는 것보다 이들 '부분적으로 중공'플러그를 분리하는 많은 판을 소요한다는 것이다. 벽 효과 반경 패킹 밀도의 변화와 관련된 문제를 확대 대역을 극복하기 위해, 액티브 플로우 기술 (AFT)라는 열 기술의 새로운 형태가 ^{7,19 설계} 하였다. 이러한 설계의 목적이었다컬럼 ^(19)의 방사상 중심 영역에 용출 이동상과는 벽 영역을 따라 용출 용매의 물리적 분리 벽을 통해 효과를 제거한다. AFT 열 두 가지 유형이있다; 병렬 분단 흐름 (PSF) 열 및 커튼 흐름 (CF) 열 ^일곱. 이 프로토콜은 CF 컬럼의 최적화를 대상으로하기 때문에, PSF 열은 더 이상 설명되지 않을 것이다.

커튼 흐름 (CF)

커튼 흐름 (CF)가 열 형식 입구 및 컬럼의 출구 모두에서 AFT 엔드 피팅 이용한다. AFT 최종 피팅은 멀티 피팅 내부에있는 환상 프릿으로 구성되어 있습니다. 프릿은 세 부분으로 구성된다 : 부속 단부의 중앙 포트 피팅 단부의 주연 포트 (들)과 정렬되는 다공성 외측 부분, 및 배리어 링과 정렬 다공성 방사상 중앙부 그 어떤 단면을 막는 다공질 두 부분을 분리. 상기 유리 재 ^(19)의 반경 방향의 중앙과 외측부 사이 -flow 하나는 AFT 프릿의 설계를 도시한다도 2는 CF 칼럼 포맷을 나타낸다. 추가 이동상의 방사상 중심 영역을 통해 용질의 이동 '커튼'의 입구의 주변 포트를 통해 유입되는 동안 동작 모드 (CF)의 샘플은 피팅의 입구의 직경 중심 포트에 주입 기둥. 그러므로 시료는 그것을 통과 이동상을 갖는 컬럼의 외측 영역과 열 방사상 중심 영역에 침대 들어간다. (말초 포트 중앙)을 4.6 mm 내부 직경 (ID) 칼럼의 최종 피팅 입구 최적 ^6,7,16 인 연구는 약 40:60의 용적 유량비는 것을 보여 주었다. CF 열의 AFT 출구 상대 부 중앙과 주변 유동의 조정이 가능하고 거의 모든 소정 rati로 변화 될 수있다압력 관리를 통해 오. CF 컬럼의 최적화 등이 크게 분리 효율이나 검출 감도 열 기술의 다양한 기능적 측면을 개선 할 수있다. 이러한 방식으로는 '벽없는', '무한 직경'또는 '가상'열은 ^{6,10,18,20를} 설립한다. CF 열 목적 적극적 벽 영역에 도달하는 샘플을 방지하기 위해 칼럼을 통해 샘플의 이동을 관리하는 것이다. 따라서, 검출기 종료시의 용질 농도는 자외선 (UV) 검출부 ^(16)를 사용하는 경우에도 질량 스펙트럼 검출 ^6을 이용하여 더 큰 경우, 종래의 열 형식보다 약 2.5 배 이상의 감도 증가를 극대화한다.

검출 감도가 향상되므로 CF 컬럼은 이상적으로 낮은 농도의 시료에 적합하다. 이러한 질량 분석기 (MS) ^(6)과 같은 속도 제한 검출기를 흐르게하도록 결합 될 때, 또한 그들은 이상적이다. 하는 A예를 들어, 4.6 mm 자료 형식 FT 칼럼은 21 %의 중심 흐름을 종료 조정함으로써, 동일한 선 속도로 작동 할 경우 표준 2.1 mm ID 포맷 열로 검출기에 용매를 동일한 볼륨을 제공하도록 조정될 수있다. 마찬가지로 AFT 칼럼은 43 %의 중심 흐름을 종료 조정함으로써 3.0 mm ID 항목으로서 검출기 동일한 용적 부하를 제공하도록 튜닝 될 수있다. 실제로 임의의 "가상 '열 형식 분석 ^{6,18,22 요구에} 맞게 제조 될 수있다. 입구에서이 특별히 디자인 된 최종 피팅을 사용하고, 출구는 진정한 벽없는 열이 설립되는 것을 보장한다.

입구의 중추 및 말초 포트 용매 전달 시스템 설정하는 방법은 두 가지가 있습니다. 분할 흐름 시스템 ^(6)와 두 개의 펌프 시스템의 ^{6,7 3이} CF 시스템 세트 업의 각을 보여줍니다.

분할 유동 시스템

나는NA 분할 유동 시스템 (도 3a) 인젝터로 이어지는 펌프 유량은 이동상 이상의 유동 스트림은 다음에 접속하는 인젝터에 연결된 제로 데드 볼륨 T 피스를 이용하여 분할 전 인젝터이고 컬럼의 입구 단부 피팅 중앙 포트. 이동상의 제 2 유동 스트림 인젝터 작성자는-통과하여 컬럼 입구의 주변 포트에 연결된다. 중앙과 주변에 펌프 분사기로부터 라인 컬럼에 접속되기 전에, 즉 : 흐름의 분할 중에 유동 흐름 비율은 40:60 (주연 센터)로 조정된다.

두 펌프 시스템

CF 컬럼은 컬럼의 입구 단부 피팅 두 유동 스트림을 필요로한다. 설정된 HPLC 기기, 분할 흐름 오토 샘플러 / 인젝터의 종류에 따라 불가능할 수있다, 따라서 CF는 2 펌프 (도 ²¹ (b))를 통해 달성 될 수있다. 각 펌프는 할당 중앙 또는 주변 장치 포트 및 유량 중앙 포트의 유량의 40 % 및 주변 포트에 대해 60 %를 나타 내기 위해 설정된 어느 하나에 접속된다. 총 유량은 1.0 ml의 분 ^-1 인 경우, 예를 들어, 중앙 펌프 유속을 0.4 mL의 분 ^-1로 설정하고, 주변 펌프는 0.6 ml의 분 ^-1로 설정된다.

동작 모드의 선택은 HPLC 계측 및 동작 모드 크로마토 그래피에 크게 의존한다. 샘플 부하 위치와 샘플 사이의 압력의 변화 위치가 분할 유량비를 방해가 발생할 수 있으므로,이 경우에 설정 이중 펌프 최적 CF 성능을 위해 권장된다 주입 일부 자동 시료 주입기, 예를 들어. 상관없이 CF 컬럼의 입구에 대해 선택된 설정 용매 전달 시스템은 CF 출구 최적화는 동일하게 남아있다. CF 컬럼의 출구 중앙 포트는에 작은을 가진 자외선 – 가시 (UV-비스) 검출기에 부착튜브의 가능한 볼륨 않도록 후 열 죽은 볼륨의 영향을 최소화합니다. , CF 열이 좁은 구멍 열을 에뮬레이트하기 때문에, 열 배출구와 상기 검출기 사이의 데드 볼륨은 CF 증류탑의 분리 성능에 불리하다. 중앙 포트 및 효율 및 감도 대역 넓혀 손실 데드 볼륨의 영향을 최소화 할 수있는 UV-비스 검출기 사이의 배관 용적의 작은 양을 보장하기 위해 중요하다. 따라서, 좁은 보어 튜빙 (0.1 mm의 ID)의 사용을 용이 부적절한 데드 볼륨을 첨가하지 않고, 압력 조정을 허용하도록 의뢰한다. 튜브는 주변 포트에 연결된 폐기물에 관한 것이다. CF 컬럼의 출구에, 분할 비율은 분석의 목적에 적합한 임의의 비율로 조절할 수있다. 4.6 mm 아이디 CF가 사용되는 경우, 예를 들면, 어느 43:57 또는 21:79 (중앙 말초)와 같은 비율로 설정하는 것이 편리한 '가상'3.0 mm ID 열 또는 2.1 mm ID 열 에뮬레이션을공손히. 그 방법은 분리 성능은 쉽게 벤치 마크입니다. 분할 비율은 상기 중앙 포트에 접속되고,주기 시간 동안 상기 주변 포트를 빠져 나가는 유동되는 검출기로부터 나오는 유량을 계량에 의해 측정된다. 각 포트를 통해 유동 비율은 측정 할 수 있고, 비율이 튜브 장착의 길이를 변경하거나, 다른 내부 직경 (ID)을 갖는 튜브를 사용하여 조정될 수있다.

이 비디오 프로토콜은 향상된 크로마토 그래피 성능을 위해 CF 칼럼의 운영 및 최적화 과정을 자세히 설명합니다.

Protocol

주의 : (메탄올에 대한, 즉 MSDS)를 사용하기 전에 모든 재료 및 시약에 대한 물질 안전 보건 자료 (MSDS)를 참조하십시오. 용매 및 고성능 액체 크로마토 그래피 (HPLC) 용리액을 처리 할 때 모든 적절한 안전 관행의 사용을 확인합니다. HPLC, 분석 균형과 검출기 장비의 공학적 통제의 적절한 사용을 보장하고, 개인 보호 장비 (안전 안경, 장갑, 실험실 코트, 전체 길이 바지와 폐쇄 발가락 신발)의 …

Representative Results

AFT 열은 열 상 이성을 극복하고 분리 성능을 향상시키기 위해 멀티 컬럼 엔드 피팅 전문 프릿 디자인 (도 1)를 사용하여 개발되었다. CF 크로마토 그래피 컬럼 (그림 2)의 분리 성능에 간 실험실 연구는이 프로토콜 (23)의 3 절에 설명 된대로 (그림 3B)를 설정 이중 펌프 시스템을 실시 하였다. 세 컴포넌트 테스트 혼합물은 CF 열의 …

Discussion

본 연구는 효율 및 감도의 측면에서 분석 성능을 테스트하기 위해 CF 크로마토 그래피 컬럼 간 실험실 분석을 포함했다. 3 '섹션에 설명 된대로 CF 열은 이중 펌핑 시스템으로 설정했다. (: 주변 센터)가 CF 컬럼의 입구에 이중 펌프 시스템은 40:60의 흐름 비율을 달성하기 위해 '설정합니다. 40:60 (중앙 말초) 유량의 비율은 각각 40 % 및 총 유량의 60 %를 나타내는 값으로, 각 펌프의 유량을 설정하?…

Materials

HPLC instrument
Additional Pump			Required if 2 pump CF system set up is to be used.
Curtain Flow HPLC column	Thermo Fisher Scientific	Not Defined	Soon to be commercialised
Methanol	Any brand		HPLC Grade
PEEK tubing	Any brand		Various lengths and i.d.
PEEK tube cutter	Any brand
Analytical Scale Balance	Any brand
Stop watch	Any brand
Eluent collection vessels	Any brand		1-2 mL Sample vials can be used as eluent collection vessels
T-piece	Any brand