Cortina Fluxo Coluna: Optimização da Eficiência e Sensibilidade

Summary

Here, we present a protocol for the operation and optimization of Active Flow Technology (AFT) column in Curtain flow (CF) mode for enhanced separation performance.

Abstract

Active Flow Technology (AFT) is a form of column technology that increases the separation performance of a HPLC column through the use of a specially purpose built multiport end-fitting(s). Curtain Flow (CF) columns belong to the AFT suite of columns, specifically the CF column is designed so that the sample is injected into the radial central region of the bed and a curtain flow of mobile phase surrounding the injection of solute prevents the radial dispersion of the sample to the wall. The column functions as an ‘infinite diameter’ column. The purpose of the design is to overcome the radial heterogeneity of the column bed, and at the same time maximize the sample load into the radial central region of the column bed, which serves to increase detection sensitivity. The protocol described herein outlines the system and CF column set up and the tuning process for an optimized infinite diameter ‘virtual’ column.

Introduction

Nos últimos anos a tecnologia de coluna para cromatografia líquida de alta resolução (HPLC) avançou muito; capacidades de pico aumentou consideravelmente em grande parte devido à utilização de menores tamanhos de partículas e as partículas de casca de núcleo mais eficazes. Uma vez que as separações são geralmente mais eficientes, um fluxo em efeito tem havido um aumento na sensibilidade desde picos são agora mais acentuada e, portanto, mais alto ^1-8.

No entanto, a heterogeneidade cama radial ainda é um fator limitante no desempenho de todas as colunas, mas esta não é uma nova história desde cromatógrafos já sabem disso há muitos anos. Coluna camas são heterogéneos, tanto na direcção radial ^9-12, e ao longo do eixo da coluna ^10,12-15. O efeito de parede especialmente é um importante contribuinte para a perda de ^7,16-18 desempenho de separação. Shalliker e Ritchie ⁷ recentemente revista aspectos de heterogeneidade leito da coluna e, portanto, este não precisa ser Discussed aqui ainda mais. Embora Basta dizer, que a variação na coluna densidade de empacotamento de cama e os efeitos de parede levar a uma distorção do bujão de soluto, de tal forma que as bandas eluir através da coluna em fichas que se assemelham parcialmente cheios sopa taças em vez de discos sólidos planas finas ⁷ que são geralmente representado em textos básicos de ensino. Quando as experiências foram realizadas de tal modo que a migração de soluto através do leito poderia ser visualizado os perfis de encaixe no interior da coluna foram parcialmente oco e a secção de cauda da banda é em grande parte do componente da parede do êmbolo da amostra. O resultado final é que leva muito mais placas para separar estas fichas 'parcialmente ocos' do que seria necessário se os discos foram sólida e plana ^12,14,17. Para superar a banda ampliando questões associadas com efeitos de parede e a variação na densidade de empacotamento radial, uma nova forma de tecnologia de coluna conhecido como tecnologia Active Flow (AFT) foi projetado ^7,19. A finalidade deste desenho foipara remover os efeitos de parede por meio da separação física do solvente de eluio ao longo da região da parede, a partir da fase móvel que eluindo na região central radial da coluna ^19. Existem dois tipos principais de colunas AFT; Colunas paralelas segmentada Flow (PSF) e colunas cortina de fluxo (CF) ^7. Uma vez que este protocolo visa a utilização e otimização de colunas CF, não será discutido colunas do PSF.

Cortina de fluxo (CF)

Cortina formatos de coluna de fluxo (FC) utilizam extremidades de cabos AFT, tanto a entrada e a saída da coluna. AFT extremidades de cabos constituída por uma frita anelar localizada no interior de um encaixe de múltiplas portas. A frita é constituída por três partes: uma porção central radial poroso que está alinhado com o orifício de centro da extremidade de encaixe, uma porção exterior porosa que está alinhada com a porta periférica (s) da extremidade de encaixe, e um anel impermeável que separa as duas partes porosas impedindo qualquer cruz-flow entre as regiões centrais e externas radiais do filtro poroso ^19. A Figura 1 ilustra o desenho da frita AFT e Figura 2 ilustra o formato de coluna CF. Neste modo de operação (CF), a amostra é injectada no porto central radial do encaixe de entrada, enquanto que a fase móvel adicional é introduzido através da porta periférica da entrada de "cortina" a migração de solutos através da região central radial da coluna. Por isso, a amostra entra no leito na região central radial da coluna com a região exterior da coluna com fase móvel única passada através dela. Estudos têm demonstrado que uma razão volumétrica taxa de fluxo de cerca de 40:60 (Central: porta periférica) para a entrada de ajuste final de um 4,6 mm de diâmetro interno (ID) é óptima ^6,7,16. A saída da popa da coluna CF permite o ajuste do fluxo central e periférica para a sua porção relativa e pode ser variada para quase qualquer desejado ratio através de uma gestão de pressão. A optimização de uma coluna CF pode melhorar significativamente vários aspectos funcionais da tecnologia de coluna, tais como a eficiência de separação ou a sensibilidade da detecção. Desta forma uma "parede-menos ',' infinita de diâmetro 'ou coluna' virtual 'é estabelecida ^6,10,18,20. A finalidade de colunas CF é de gerir activamente a migração da amostra através da coluna para evitar a amostra de atingir a região de parede. Assim, a concentração de soluto na saída para o detector é maximizada, aumentando assim a sensibilidade de cerca de 2,5 vezes maior do que o formato de coluna convencional ao usar ultravioleta (UV) de detecção de ^16, e ainda maior quando se utiliza a detecção de espectro de massa ^6.

colunas CF são idealmente adequados para amostras de baixa concentração, uma vez que a sensibilidade de detecção é aumentada. Além disso, eles são ideais quando acoplado a fluir detectores limitados taxa, tais como o espectrómetro de massa (MS) ^6. um AFT coluna em um formato ID 4,6 mm, por exemplo, pode ser sintonizado para fornecer o mesmo volume de solvente para um detector como uma coluna ID de formato padrão 2,1 mm, quando operado com a mesma velocidade linear, ajustando sair fluxo central a 21%. De igual modo a coluna AFT também podem ser ajustadas para fornecer o mesmo volume de carga para um detector como uma coluna ID de 3,0 mm, através do ajuste central para sair o fluxo de 43%. Na verdade, qualquer formato de coluna "virtual" poderia ser produzido para atender a exigência analítica ^6,18,22. Usando estas-acessórios terminais especialmente concebidos para a entrada e a de saída garante que uma verdadeira coluna de parede inferior é estabelecida.

Há duas maneiras de configurar o sistema de distribuição de solvente para os portos centrais e periféricas da entrada:. Sistema de divisão de fluxo de ⁶ e dois ^6,7 sistema de bomba Figura 3 ilustra cada um desses sistemas CF set ups.

Sistema de divisão de fluxo

Eund sistema de divisão de fluxo (Figura 3A) o caudal da bomba que conduz para o injector é dividida pré-injector usando um morto de zero volume de peça em T, onde uma corrente de fluxo da fase móvel é ligada para o injector, que é então ligado ao porta de entrada central do fim-de encaixe da coluna. A segunda corrente de fluxo de fase móvel by-pass do injector e é ligada à porta periférica na entrada da coluna. Durante a separação de fluxo, a percentagem corrente de escoamento é ajustado para 40:60 (centro: periférica) antes de as linhas são ligadas à coluna, isto é, a partir do injector para o centro da bomba e do periférico.

Sistema de duas bombas

A coluna CF requer duas correntes de fluxo na extremidade de entrada-montagem da coluna. Dependendo do tipo de auto-amostrador / injector do instrumento de HPLC, de fluxo dividido definido acima pode não ser possível, e assim por CF pode então ser alcançada através de bombas 2 (Figura 3b) ²¹. Cada bomba está atribuída e conectada com a porta da central ou periférica e a velocidade de fluxo é definida para representar 40% do fluxo para a porta central e de 60% para a porta periférica. Por exemplo, se a taxa de fluxo total é de 1,0 ml ^min-1, a taxa de fluxo da bomba central é definida como 0,4 ml min ^-1 e a bomba periférico é configurado para 0,6 ml min ^-1.

A escolha de qual o modo de operação é em grande parte dependente da instrumentação HPLC e modo de operação cromatográfica. Por exemplo, em alguns autosamplers uma mudança na pressão entre a posição de carga de amostra e amostra injectar posição pode ocorrer interromper a taxa de divisão de fluxo e, portanto, neste caso, uma bomba de dupla configurar seria recomendada para um desempenho óptimo CF. Independentemente do sistema de distribuição de solvente configuração escolhidos para a entrada da coluna CF, CF, a optimização de saída continua a ser a mesma. A porta central de saída da coluna CF está ligado ao detector de ultravioleta-visível (UV-VIS) com o smalpara que o volume possível de tubulação para minimizar os efeitos de volume morto pós-coluna. Uma vez que, colunas CF emular colunas estreita de cano, o volume morto entre a saída da coluna e o detector é prejudicial para o desempenho de separação da coluna CF. É crítico para assegurar a quantidade mais pequena de volume de tubagem entre a porta central e o detector de UV-Vis de minimizar os efeitos de volume morto, como alargamento de banda, perda de eficiência e sensibilidade. Por isso, a utilização de tubos de diâmetro estreito (0,1 mm DI) é aconselhado para permitir facilmente ajustes de pressão, sem adição de um volume morto inadequado. Tubos também está ligado à porta periférico e dirigido para o lixo. Após a saída da coluna de CF, a relação de segmentação pode ser ajustado a qualquer relação que ajusta o propósito do analista. Quando um CF ID de 4,6 milímetros é usado, por exemplo, muitas vezes é conveniente para ajustar a relação de 43:57 ou 21:79, quer (centro: periférica) para emular uma coluna ID de 3,0 milímetros "virtual" ou coluna ID de 2,1 milímetros,respeitosamente. Dessa forma, o desempenho da separação é facilmente marcado banco. O rácio de segmentação é medida pesando a quantidade de fluxo de saída a partir do detector, que é ligado à porta central e o fluxo que sai da porta periférica ao longo de um período de tempo. A percentagem de fluxo através de cada porta pode então ser determinada e as proporções podem ser ajustadas alterando o comprimento do tubo ligado ou utilizando tubagem que tem um diâmetro interno diferente (ID).

Este protocolo de vídeo detalha os procedimentos de operação e otimização de uma coluna CF para o desempenho cromatográfica melhorada.

Protocol

Cuidado: Por favor, consulte as fichas de dados de segurança de material (MSDS) para todos os materiais e reagentes antes do uso (ou seja, MSDS para o metanol). Garantir a utilização de todas as práticas de segurança adequadas ao manusear solventes e High Performance Liquid Chromatography (HPLC) eluente. Assegurar o uso apropriado de controles de engenharia de HPLC, analítica equilíbrio e detector de instrumentação, e assegurar o uso de equipamentos de proteção individual (óculos de segurança, luva…

Representative Results

AFT colunas foram desenvolvidas utilizando um design de frita especializado (Figura 1) na coluna de múltiplas extremidades de cabos para superar a heterogeneidade do leito da coluna e melhorar o desempenho da separação. Um estudo inter-laboratório sobre o desempenho separação de colunas de cromatografia CF (Figura 2) foi realizada com um sistema de bombas duplas configurado (Figura 3B), conforme descrito na seção 3 deste protocol…

Discussion

Este estudo envolveu a análise inter-laboratorial de colunas de cromatografia CF para testar o desempenho analítico em termos de eficiência e sensibilidade. A coluna CF foi criada com um sistema de bombeamento dupla como descrito na secção «3. sistema de bomba dupla configurar 'para alcançar uma relação de fluxo de 40:60 (centro: periférica) na entrada da coluna CF. O 40:60 (centro: periférica) razão de fluxo foi conseguida ajustando a velocidade de fluxo de cada bomba para o valor que representa 40% e 6…

Materials

HPLC instrument
Additional Pump			Required if 2 pump CF system set up is to be used.
Curtain Flow HPLC column	Thermo Fisher Scientific	Not Defined	Soon to be commercialised
Methanol	Any brand		HPLC Grade
PEEK tubing	Any brand		Various lengths and i.d.
PEEK tube cutter	Any brand
Analytical Scale Balance	Any brand
Stop watch	Any brand
Eluent collection vessels	Any brand		1-2 mL Sample vials can be used as eluent collection vessels
T-piece	Any brand