Завесой Колонка: Оптимизация эффективности и чувствительности

Summary

Here, we present a protocol for the operation and optimization of Active Flow Technology (AFT) column in Curtain flow (CF) mode for enhanced separation performance.

Abstract

Active Flow Technology (AFT) is a form of column technology that increases the separation performance of a HPLC column through the use of a specially purpose built multiport end-fitting(s). Curtain Flow (CF) columns belong to the AFT suite of columns, specifically the CF column is designed so that the sample is injected into the radial central region of the bed and a curtain flow of mobile phase surrounding the injection of solute prevents the radial dispersion of the sample to the wall. The column functions as an ‘infinite diameter’ column. The purpose of the design is to overcome the radial heterogeneity of the column bed, and at the same time maximize the sample load into the radial central region of the column bed, which serves to increase detection sensitivity. The protocol described herein outlines the system and CF column set up and the tuning process for an optimized infinite diameter ‘virtual’ column.

Introduction

В последние годы технология колонки для высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) значительно продвинулся вперед; пиковые мощности значительно увеличились во многом благодаря использованию меньшего размера частиц и более эффективных частиц ядра оболочки. Поскольку разделений , как правило , более эффективны, поток-на эффект наблюдается увеличение чувствительности , так как пики теперь острее и , следовательно , выше ^1-8.

Тем не менее, радиальная кровать гетерогенность по-прежнему является ограничивающим фактором при выполнении всех столбцов, но это не новая история, так как хроматографы знали это в течение многих лет. Колонка кровати неоднородны как в радиальном направлении ^9-12, а вдоль колонны оси ^10,12-15. Стенка эффект особенно является важным фактором , способствующим утрате ^7,16-18 эффективности разделения. Shalliker и Ритчи ⁷ недавно рассмотрели аспекты колонки кровати неоднородности и , следовательно , это не обязательно должен быть discussed здесь дальше. Несмотря на то, достаточно сказать, что, что изменение в колонке плотности кровати упаковки и эффекты стены приводят к искажению растворенного вещества пробки, таким образом, что полосы элюирования через колонку в пробках , которые напоминают частично заполненных миски , а не тонких плоских твердых дисков ^7, которые обычно изображается в основных текстах обучения. Когда эксперименты были проведены таким образом, что растворенное вещество миграции через слой может быть визуализированы штепсельные профили внутри колонны были частично полым и секция хвостохранилища группы в значительной степени стена компонент образца пробки. Конечным результатом является то, что она занимает гораздо больше пластин , чтобы отделить эти «частично полые» пробки , чем требовалось бы , если диски были твердыми и плоскими ^12,14,17. Для преодоления полосы уширения вопросов , связанных с настенными эффектов и изменения радиальной плотности упаковки, новая форма технологии колонки известной как технологии активного потока (AFT) был разработан ^7,19. Цель этой конструкции былочтобы удалить стенные эффекты через физическое разделение элюирующего растворителя вдоль области стенки, от подвижной фазы при элюировании в радиальном центральной части колонны ^19. Есть два основных типа AFT колонн; Параллельные сегментированные Flow (PSF) колонны и занавес Flow (CF) колонки ^7. Поскольку этот протокол направлен на использование и оптимизации колонн CF, PSF столбцы не будут обсуждаться.

Завесой (CF)

Завесой (CF) форматы колонки используют AFT концевые фитинги на обоих входе и выходе из колонки. AFT концевые фитинги состоят из кольцевого фритты, расположенной внутри мультипортовой штуцером. Фритты состоит из трех частей: пористый радиальную центральную часть, выровненную с центральным портом концевой заделки, пористой внешней части, которая совмещена с периферийным портом (ами) концевой заделки и непроницаемым кольцом, разделяет две пористые участки, предотвращающие любые крест-Flow между радиальными центральных и внешних областях фритты ^19. Рисунок 1 иллюстрирует конструкцию AFT фритту и рисунке 2 показан формат столбца CF. В этом режиме работы (CF) образец впрыскивается в радиальном центральный порт входного патрубка, в то время как дополнительный подвижной фазы вводится через периферическую порт входа к «занавесом» миграции растворенных веществ через радиальный центральной области колонка. Следовательно, образец поступает в слой в радиальном центральной зоне колонны с внешней области колонны, имеющей состав подвижной фазы передается только через него. Исследования показали , что объемное отношение скорости потока около 40:60 (центральный: периферийный порт) для входного конца облегающие колонки 4,6 мм внутренний диаметр (ID) оптимальна ^6,7,16. AFT выходе из колонки CF позволяет регулировать центральной и периферической потока их относительной части и может изменяться почти любой желаемой ратиO через управление давлением. Оптимизация колонки CF может значительно улучшить различные функциональные аспекты технологии колонки, такие как эффективность разделения или чувствительности обнаружения. Таким образом , а 'стена-меньше "," бесконечномерным диаметр "или" виртуальной "столбец устанавливается ^6,10,18,20. Целью колонн CF является активно управлять миграцией образца через колонку, чтобы предотвратить образца от проникновения в область стенки. Таким образом, концентрация растворенного вещества при выходе на детектор максимизируется, повышающий чувствительность примерно в 2,5 раза больше , чем в обычном формате колонки при использовании ультрафиолетового (УФ) обнаружения ^16, и еще больше при использовании масс – спектрометрического обнаружения ^6.

Столбцы CF идеально подходят для низких образцов концентрации, так как чувствительность обнаружения увеличивается. Кроме того, они идеально подходят в сочетании с скорость потока ограниченных детекторов, таких как масс – спектрометр (MS) ^6.FT колонке в формате Идентификатор 4,6 мм, например, может быть настроен, чтобы поставить один и тот же объем растворителя к детектору в качестве стандартного 2,1 мм колонки формата ID при работе при тех же линейных скоростей, путем регулировки выхода центрального потока до 21%. Точно так же в кормовой части колонна также может быть настроен, чтобы поставить ту же нагрузку объема на детектор в качестве столбца Идентификатор 3,0 мм, путем регулировки выхода из центрального потока до 43%. На самом деле любой "виртуальной" формат столбца может быть получен в соответствии с аналитическим требование ^6,18,22. С помощью этих специально разработанные концевые фитинги на входе и на выходе гарантирует, что истинная стенка менее колонна установлена.

Есть два способа установки растворителя систему доставки в центральных и периферийных портов на входе:. Системы ⁶ сплит-потока и два насоса системы ^6,7 Рисунок 3 иллюстрирует каждый из этих ИБП множество системных CF.

Сплит – система потока

яна системы с разделенным потоком (рис 3А) поток насоса приводит к инжектору расщепляется предварительно инжектор с использованием нулевого мертвого объема тройник, где один поток поток подвижной фазы соединен с инжектором, который затем соединяли с центральный порт впускного конца закрывающейся колонны. Второй поток поток подвижной фазы перепускных каналов инжектора и соединен с периферийным портом на входе колонки. Во время разделения потока, процент потока потока доводят до 40:60 ( в центре: периферические) до того , как линии подключены к колонке, т.е. от инжектора до центра и насоса к периферийным.

Система Два насоса

Столбец CF требует двух потоков потока на входном конце закрывающейся колонны. В зависимости от типа автоматического пробоотборника / инжекторе ВЭЖХ приборов, сплит-капельнице вверх может оказаться невозможным, и поэтому CF может затем быть достигнуто с помощью 2 -х насосов (фигура 3В ²¹⁾, Каждый насос выделяется и соединен либо с центральной или периферической порта и скорость потока устанавливается на составляет 40% от потока для центрального порта и 60% для периферийного порта. Например, если общая скорость потока 1,0 мл мин ^-1, центральный расход насоса устанавливается на 0,4 мл мин ^-1 и периферийная насос установлен на 0,6 мл мин – ^1.

Выбор режима работы, который в значительной степени зависит от ВЭЖХ-измерительных приборов и хроматографического режиме работы. Например, в некоторых автоматических пробоотборников изменение давления между положением нагрузки образца и образца впрыснуть положение может произойти срыв отношение разделения потока и, следовательно, в этом случае сдвоенный насос установить будет рекомендовано для обеспечения оптимальной производительности CF. Независимо от растворителя системы доставки, созданной выбранной для входного отверстия колонны CF, оптимизация на выходе CF остается тем же самым. Выпускная центральный порт колонны CF прикреплен к детектору видимой области ультрафиолетового (УФ-Вид) с помощью SmaIчтобы объем возможной насосно-компрессорных труб, чтобы свести к минимуму последствия после колонки мертвого объема. Так, CF столбцы эмулировать узок туннелем колонны, мертвый объем между выходе из колонки и детектора отрицательно сказывается на эффективности разделения колонны CF. Крайне важно, чтобы обеспечить наименьшее количество объема трубопровода между центральным отверстием и UV-VIS детектора, чтобы свести к минимуму влияние мертвого объема, таких как полосы расширения, потери эффективности и чувствительности. Следовательно, использование узкого внутреннего диаметра трубки (0,1 мм ID) рекомендуется легко разрешить корректировки давления без добавления нежелательного мертвого объема. НКТ также прилагается к периферийному порту и направляется в отходы. При выходе из колонки CF, коэффициент сегментации может быть отрегулирован на любом соотношении, которое соответствует цели аналитика. Когда CF ID 4,6 мм используется, например, часто бывает удобно установить соотношение либо как 43:57 или 21:79 (в центре): периферическая эмулировать 'виртуальную' 3,0 мм колонки удостоверения личности или 2,1 мм столбец ID,С уважением. Таким образом, производительность сепарации легко скамейка обозначенным. Отношение сегментации измеряется путем взвешивания количества потока, выходящего из детектора, который подключен к центральному порту и потока выходящего из периферийного порта в течение периода времени. Процент потока через каждый из портов, то можно определить и соотношения можно регулировать путем изменения длины трубки, присоединенные или с помощью трубки, которая имеет различный внутренний диаметр (ID).

Это видео протокол подробно описываются процедуры эксплуатации и оптимизации колонки CF для расширения хроматографического производительности.

Protocol

Внимание: Пожалуйста , обратитесь к паспорте безопасности (MSDS) для всех материалов и реагентов перед использованием (т.е. паспорт безопасности для метанола). Обеспечивать использование всех соответствующих правил безопасности при работе с растворителями и высокоэффективной жидк?…

Representative Results

AFT колонны были разработаны с использованием специализированной конструкции фриттиванного (рисунок 1) в колонке мультипортовый концевой арматурой , чтобы преодолеть кровать гетерогенность колонки и повышения эффективности разделения. Межлабораторная иссл…

Discussion

Это исследование включало в межлабораторный анализ хроматографических колонок CF, чтобы проверить аналитические показатели с точки зрения эффективности и чувствительности. Колонна CF была создана с двойной насосной системы, как описано в разделе «3. Двойная насосная система создана &#39…

Materials

HPLC instrument
Additional Pump			Required if 2 pump CF system set up is to be used.
Curtain Flow HPLC column	Thermo Fisher Scientific	Not Defined	Soon to be commercialised
Methanol	Any brand		HPLC Grade
PEEK tubing	Any brand		Various lengths and i.d.
PEEK tube cutter	Any brand
Analytical Scale Balance	Any brand
Stop watch	Any brand
Eluent collection vessels	Any brand		1-2 mL Sample vials can be used as eluent collection vessels
T-piece	Any brand