Gardin Flow-kolonn: Optimering av effektivitet och känslighet

Summary

Here, we present a protocol for the operation and optimization of Active Flow Technology (AFT) column in Curtain flow (CF) mode for enhanced separation performance.

Abstract

Active Flow Technology (AFT) is a form of column technology that increases the separation performance of a HPLC column through the use of a specially purpose built multiport end-fitting(s). Curtain Flow (CF) columns belong to the AFT suite of columns, specifically the CF column is designed so that the sample is injected into the radial central region of the bed and a curtain flow of mobile phase surrounding the injection of solute prevents the radial dispersion of the sample to the wall. The column functions as an ‘infinite diameter’ column. The purpose of the design is to overcome the radial heterogeneity of the column bed, and at the same time maximize the sample load into the radial central region of the column bed, which serves to increase detection sensitivity. The protocol described herein outlines the system and CF column set up and the tuning process for an optimized infinite diameter ‘virtual’ column.

Introduction

Under de senaste åren kolumnen teknik för högupplösande vätskekromatografi (HPLC) har avancerat kraftigt; toppkapacitet har ökat betydligt tack vare användningen av mindre partikelstorlekar och effektivare kärna skalp. Eftersom separationer är i allmänhet mer effektiva, har en flödeseffekt varit en ökning i känslighet eftersom toppar är nu vassare och därmed högre ^1-8.

Ändå är radiell säng heterogenitet fortfarande en begränsande faktor i utförandet av alla kolumner, men detta är inte en ny berättelse eftersom chromatographers har vetat det i många år. Kolumn sängar är heterogen både radiell riktning ^9-12, och längs kolumnen axeln ^10,12-15. Väggen effekt är särskilt en viktig bidragsgivare till förlust av separationsprestanda ^7,16-18. Shalliker och Ritchie ⁷ nyligen granskat aspekter av kolonnbädden heterogenitet och därmed detta behöver inte vara discussed här ytterligare. Även det räcker att säga, att variationen i kolonnbädden packningstäthet och vägg effekter leder till en snedvridning av lösta kontakten, så att banden elueras genom kolonnen i pluggar som liknar delvis fyllda soppskålar i stället för tunna platta fasta skivor ⁷ som är brukar avbildas i grundläggande undervisning texter. När experiment genomfördes så att det lösta ämnet migration genom bädden kan visualiseras pluggprofilerna inuti kolonnen var delvis ihålig och svans delen av bandet är i stort sett väggen komponenten i provpluggen. Slutresultatet är att det tar många fler plattor för att separera dessa "delvis ihåliga" pluggar än vad som skulle krävas om skivorna var fast och platt ^12,14,17. För att övervinna bandbreddning frågor i samband med väggeffekter och variationen i radiell packningstäthet, en ny form av kolumn teknik som kallas Active Flow Technology (AFT) utformade ^7,19. Syftet med denna design varför att ta bort väggeffekter genom den fysiska separationen av lösningsmedels eluerande längs väggområdet, från den för mobil fas eluerades i den radiella mittområdet av kolonnen ^19. Det finns två huvudtyper av AFT kolumner; Parallella segmenterat flöde (PSF) kolumner och Curtain Flow (CF) kolumnerna ^7. Eftersom detta protokoll syftar till användning och optimering av CF kolumner kommer PSF kolumner inte att diskuteras vidare.

Gardin Flöde (CF)

Gardin Flow (CF) kolonnformat utnyttjar AFT slutlutande både inloppet och utloppet hos kolonnen. AFT slut beslag består av ett ringformat frit placerad inuti en multi montering. Frittan består av tre delar: en porös radiell centralt parti som är i linje med den centrala porten på ändbeslaget, ett poröst yttre parti som är i linje med den perifera port (ar) av ändbeslaget, och ett ogenomträngligt ring som separerar porösa två delar förhindra kors-flow mellan de radiella centrala och yttre områdena av frittan ¹⁹ Fig. 1 illustrerar utformningen av AFT-fritta och Figur 2 illustrerar CF kolumnformat. I denna driftsmod (CF) provet injiceras i den radiella centrala porten på inloppsanslutningen, medan ytterligare mobil fas införes genom den perifera hamnen i inloppet till "gardin" migreringen av lösta ämnen genom den radiella mittområdet av det kolumn. Hence provet kommer in i bädden i den radiella mittområdet av kolonnen med det yttre området av kolonnen som har mobila fasen endast passerar genom denna. Studier har visat att ett volymförhållande flödeshastighet av cirka 40:60 (central: perifer port) för inloppsänden passning av en kolonn 4,6 mm innerdiameter (ID) är optimal ^6,7,16. AFT utlopp CF kolumnen medger justering av det centrala och perifera flödet till deras relativa delen och kan varieras för att nästan vilken som helst önskad ratio genom tryckledningen. Optimeringen av ett CF-kolonn kan avsevärt förbättra olika funktionella aspekterna av kolonnen teknik, såsom separationseffektiviteten eller detektionskänslighet. På detta sätt en "vägg-mindre", "oändlig diameter" eller "virtuella" kolumnen är etablerad ^6,10,18,20. Syftet med CF kolumner är att aktivt hantera den migrering av provet genom kolonnen för att förhindra provet från att nå väggområdet. Således är lösta koncentration vid utgång till detektorn maxim, öka känsligheten på cirka 2,5 gånger större än den konventionella kolumnformat när du använder ultraviolett (UV) detektering ^16, och ännu större när man använder masspektrala upptäckt ^sex.

CF kolonner är idealiska för prover låg koncentration, eftersom detektionskänsligheten ökar. Vidare, de är idealiska när den är kopplad till flödeshastighet begränsade detektorer, såsom masspektrometer (MS) ^6. en AFT-kolonn i en 4,6 mm id-format, till exempel kan avstämmas för att leverera samma volym av lösningsmedel till en detektor som en standard 2,1 mm kolonn id-format när den drivs vid samma linjära hastigheter, genom att justera spännande centrala flödet till 21%. Likaledes AFT kolumnen kan också vara inställda att leverera samma volymbelastning till en detektor som en 3,0 mm id-kolonn, genom att justera spännande centrala flödet till 43%. I själva verket någon "virtuell" kolumnformat kan framställas för att passa den analytiska krav ^6,18,22. Med användning av dessa särskilt utformade slut rördelar vid inloppet och utloppet säkerställer att en sann vägg mindre kolonn är etablerad.

Det finns två sätt att ställa upp vätskan leveranssystem till de centrala och perifera hamnar i inloppet. Delad flödessystem ⁶ och två pumpsystem ^6,7 Figur 3 visar var och en av dessa CF system som ups.

Split-flödessystem

jagna delat flöde system (figur 3A) pumpflödet som leder till injektorn är delad för-injektor med användning av en noll dödvolym T-stycke, där en flödesström av mobil fas är ansluten till injektom, som sedan är ansluten till centrala porten på inloppsänden passning av kolonnen. Den andra flödesströmmen av mobil fas passerar förbi injektorn och är ansluten till den perifera porten på inloppet till kolonnen. Under delning av flödet, är flödet procent justerat till 40:60 (centrum: perifer) innan ledningarna är anslutna till kolonnen, det vill säga från injektorn till centrum och pumpa till kringutrustning.

Två pumpsystem

CF kolonnen kräver två flödesströmmar vid inloppet ändinpassningen av kolonnen. Beroende på vilken typ av automatiska provtagnings / injektor av HPLC-instrument, split-flöde inrättas får inte vara möjligt, och så CF kan sedan uppnås genom 2 pumpar (Figur 3B ²¹⁾. Varje pump tilldelas och anslutas till antingen centrala eller perifera hamnen och flödeshastigheten är inställd på att representera 40% av flödet för centrala hamn och 60% för perifer port. Till exempel, om den totala flödeshastigheten är 1,0 ml min ^-1, är den centrala pumpflödeshastigheten inställd på 0,4 ml min ^-1 och det perifera pumpen är inställd på 0,6 ml min ^-1.

Valet av vilken driftsform är till stor del beroende på HPLC-instrumentering och kromatografisk driftsmod. Till exempel i vissa autosampler en förändring i tryck mellan provbelastning läge och prov injicera ställning kan uppstå störa split-flödesförhållandet och därmed i detta fall en dubbel pump inrätta skulle rekommenderas för optimal CF prestanda. Oberoende av det lösningsmedelstillförselsystem inrättat valts för inlopp av CF-kolonn, CF utlopps optimering förblir densamma. Utlopp centrala porten på CF kolumnen är ansluten till den ultraviolettsynligt (UV-Vis) detektor med smallest volym möjligt av slangen för att minimera effekterna av efterkolonn dödvolym. Eftersom CF kolumner emulera smal borrade kolumner är dödvolym mellan kolonnens utlopp och detektorn skadligt för separation prestanda CF kolonnen. Det är kritiskt för att säkerställa den minsta mängden volym av slangen mellan den centrala porten och den UV-Vis detektor för att minimera effekterna av dödvolym såsom bandbreddning, förlust i effektivitet och känslighet. Därför är användningen av smala innerdiameter (0,1 mm id) rekommenderas att lätt tillåta tryckjusteringar utan att lägga till olämpligt dödvolym. Slangar är också kopplad till den perifera hamnen och riktas till spillo. Vid utloppet av CF-kolonn, kan segmenteringsförhållandet justeras till vilket förhållande som helst som passar syftet med den som utför analysen. När en 4,6 mm id CF används, till exempel, är det ofta lämpligt att ställa in graden som antingen 43:57 eller 21:79 (centrum: perifer) att emulera en "virtuell" 3,0 mm id-kolonn eller 2,1 mm id-kolonn,respektfullt. På så sätt separationsprestanda är lätt bänk-märkt. Segmenteförhållandet mäts genom vägning av den mängd av flödes utträder från detektorn som är ansluten till den centrala porten och flödes utträder periferiporten under en tidsperiod. Den procentuella flödet genom varje port kan sedan bestämmas och förhållandena kan justeras genom att ändra längden på slangen fäst eller med hjälp av rör som har en annan inre diameter (ID).

Denna video protokoll detaljer förfarandena drift och optimering av en CF kolumnen för förbättrad kromatografiska prestanda.

Protocol

Varning: Se säkerhetsdatablad (SDB) för alla material och reagenser före användning (dvs SDB för metanol). Säkra användningen av alla lämpliga säkerhetsåtgärder vid hantering av lösningsmedel och High Performance Liquid Chromatography (HPLC) elueringsmedel. Säkerställa en lämplig användning av tekniska kontroller av HPLC analytisk balans och detektor instrumentering, och säkra användningen av personlig skyddsutrustning (skyddsglasögon, handskar, skyddsrock, fullängds byxor, och sluten tå sk…

Representative Results

AFT kolonner har utvecklats med hjälp av en specialiserad frit konstruktion (Figur 1) i multikolumnslut beslag för att övervinna kolonnbädden heterogenitet och förbättra separationsprestanda. En interlaboratoriestudie på separationsprestanda CF kromatografikolonner (Figur 2) genomfördes med ett dubbelt pumpsystem inrättas (Figur 3B) som beskrivs i avsnitt 3 av detta protokoll 23. En tre komponenttest blandningen analy…

Discussion

Denna studie omfattade mellan laboratorieanalys av CF kromatografikolonner att testa den analytiska prestandan i fråga om effektivitet och känslighet. CF kolonn inrättades med ett dubbelt pumpsystem som beskrivs i avsnittet "3. Dubbla pumpsystem inrättas "för att uppnå en flödes 40:60 (centrum: perifert) på inloppet till CF kolonnen. Den 40:60 (centrum: perifer) flödesförhållande uppnåddes genom inställning av flödeshastigheten för varje pump till det värde som representerar 40% och 60% av den …

Materials

HPLC instrument
Additional Pump			Required if 2 pump CF system set up is to be used.
Curtain Flow HPLC column	Thermo Fisher Scientific	Not Defined	Soon to be commercialised
Methanol	Any brand		HPLC Grade
PEEK tubing	Any brand		Various lengths and i.d.
PEEK tube cutter	Any brand
Analytical Scale Balance	Any brand
Stop watch	Any brand
Eluent collection vessels	Any brand		1-2 mL Sample vials can be used as eluent collection vessels
T-piece	Any brand