Gordijn Flow Column: Optimalisatie van efficiëntie en gevoeligheid

Summary

Here, we present a protocol for the operation and optimization of Active Flow Technology (AFT) column in Curtain flow (CF) mode for enhanced separation performance.

Abstract

Active Flow Technology (AFT) is a form of column technology that increases the separation performance of a HPLC column through the use of a specially purpose built multiport end-fitting(s). Curtain Flow (CF) columns belong to the AFT suite of columns, specifically the CF column is designed so that the sample is injected into the radial central region of the bed and a curtain flow of mobile phase surrounding the injection of solute prevents the radial dispersion of the sample to the wall. The column functions as an ‘infinite diameter’ column. The purpose of the design is to overcome the radial heterogeneity of the column bed, and at the same time maximize the sample load into the radial central region of the column bed, which serves to increase detection sensitivity. The protocol described herein outlines the system and CF column set up and the tuning process for an optimized infinite diameter ‘virtual’ column.

Introduction

De laatste jaren kolomtechnologie voor High Performance Liquid Chromatography (HPLC) is sterk gevorderd; piekvermogens aanzienlijk toegenomen dankzij grotendeels het gebruik van kleinere deeltjes en een efficiënter kern schildeeltjes. Aangezien scheidingen algemeen efficiënter is een stroom-effect een toename van de gevoeligheid sinds pieken nu scherper en dus groter ^1-8.

Niettemin radiale bed heterogeniteit is nog steeds een beperkende factor bij het uitvoeren van alle kolommen, maar dit is geen nieuw verhaal aangezien dit chromatographers zijn vele jaren bekend. Kolom bedden zijn heterogeen in zowel de radiale richting ^9-12, en langs de kolomas ^10,12-15. De wand-effect is vooral een belangrijke bijdrage aan het verlies van de scheiding prestaties ^7,16-18. Shalliker en Ritchie ⁷ onlangs beoordeeld aspecten van de kolom bed heterogeniteit en dus dit hoeft niet discusse zijnd hier verder. Hoewel het volstaat om te zeggen, dat de variatie in kolom bed pakkingsdichtheid en de muur effecten leiden tot een verstoring van de opgeloste stof plug, zodanig dat bands elueren door de kolom in pluggen die lijken gedeeltelijk gevuld soepkommen in plaats van dunne platte massieve schijven ⁷ die meestal afgebeeld in de basis onderwijs teksten. Bij dergelijke experimenten werden uitgevoerd dat de opgeloste migratie door het bed kan worden gevisualiseerd de stekker profielen in de kolom waren gedeeltelijk hol en de staart deel van de band grotendeels wandcomponent van het monster plug. Het eindresultaat is dat het duurt veel meer platen om deze 'gedeeltelijk hol' pluggen dan nodig zou zijn als de schijven waren solide en platte ^12,14,17 scheiden. De band verbreding kwesties in verband met wandeffecten en de variatie in radiale pakkingsdichtheid overwinnen, een nieuwe vorm van kolomtechnologie zogenaamde Active Flow Technology (AFT) is gemaakt ^7,19. Het doel van dit ontwerp waswandeffecten heffen door de fysieke scheiding van oplosmiddel eluerende langs het wandgebied, dat van de mobiele fase elueren in het radiale centrale gebied van de kolom ^19. Er zijn twee hoofdtypen van AFT kolommen; Parallel Gesegmenteerde Flow (PSF) kolommen en Curtain Flow (CF) kolommen ^7. Aangezien dit protocol is gericht op het gebruik en de optimalisatie van de CF columns, PSF kolommen worden niet verder besproken.

Gordijn Flow (CF)

Gordijn Flow (CF) kolomnotatie gebruik AFT end-fitting aan zowel de inlaat als de uitlaat van de kolom. AFT end-armaturen bestaan ​​uit een ringvormige frit zich in een multiport fitting. De frit bestaat uit drie delen: een poreus radiaal centraal gedeelte dat is uitgelijnd met de centrale poort van de eindfitting, een poreus buitengedeelte dat is uitgelijnd met de perifere poort (en) van het koppelstuk, en een ondoordringbare ring die scheidt de twee poreuze gedeelten voorkomen van kruis-Flow tussen de centrale en radiale buitengebieden van de frit ^19. Figuur 1 illustreert het ontwerp van de AFT frit en figuur 2 illustreert het CF kolomformaat. In deze modus (CF) het monster wordt geïnjecteerd in de radiale centrale poort van de inlaatfitting, terwijl aanvullende mobiele fase wordt via de perifere poort van de inlaat 'gordijn' de migratie van opgeloste stoffen door de radiale centrale gebied van de kolom. Vandaar het monster komt het bed in de radiale centrale gebied van de kolom met het buitenste gebied van de kolom met mobiele fase alleen doorleiden. Studies hebben aangetoond dat een volumestroom verhouding van ongeveer 40:60 (CV: periferiepoort) voor het inlaateinde-fitting van een kolom 4,6 mm inwendige diameter (id) optimaal ^6,7,16. De AFT uitlaat van de CF kolom maakt de aanpassing van de centrale en perifere stroom naar hun relatieve aandeel en kunnen worden gevarieerd om bijna elke gewenste ratio door de druk management. Het optimaliseren van een CF kolom kan een aanzienlijke verbetering verschillende functionele aspecten van de kolomtechnologie, zoals scheidend vermogen of detectiegevoeligheid. Op deze wijze wordt een 'wall-less', 'oneindige diameter "of kolom' virtueel 'is gevestigd ^6,10,18,20. Doel van CF kolommen actief te beheren de migratie van monster door de kolom te voorkomen dat het monster van het wandgebied bereiken. Aldus wordt de concentratie opgeloste stof bij het ​​verlaten van de detector gemaximaliseerd, verhogen van de gevoeligheid van ongeveer 2,5 maal groter dan de conventionele kolomindeling bij gebruik van ultraviolet (UV) detectie ¹⁶ en nog meer bij gebruik massaspectrale detectie ^6.

CF kolommen zijn ideaal voor lage concentratie monsters, aangezien detectiegevoeligheid toeneemt. Verder zijn ze ideaal wanneer gekoppeld aan snelheid beperkt detectoren, zoals de massaspectrometer (MS) ⁶ stromen. een AFT kolom in een 4,6 mm ID formaat, kan bijvoorbeeld worden afgestemd op dezelfde volume oplosmiddel leveren aan een detector als een standaard 2,1 mm id format kolom wanneer bedreven bij dezelfde lineaire snelheden, door instelling verlaten middenuitstromer tot 21%. Ook de AFT kolom kan ook worden afgestemd op dezelfde volumebelasting leveren aan een detector als 3,0 mm id kolom, door instelling verlaten middenuitstromer tot 43%. In feite kon geen 'virtuele' kolom-formaat worden geproduceerd om de analytische eis ^6,18,22 passen. Met deze speciaal ontworpen end-fitting aan de inlaat en de uitlaat, zodat een echte muur minder kolom vastgesteld.

Er zijn twee manieren om het opzetten van het oplosmiddel levering systeem om de centrale en perifere havens van de inlaat. Split-flow systeem ⁶ en twee pompsysteem ^6,7 Figuur 3 toont elk van deze CF-systeem set-ups.

Split-flow-systeem

ikna stroomsplitsingsproces (zie figuur 3A) het pompdebiet waardoor de injector split pre-injector met een nul-dood volume T-stuk, waarbij een vloeistofstroom mobiele fase is verbonden met de injecteur, die vervolgens wordt verbonden met de centrale poort van het inlaateinde-fitting van de kolom. De tweede stroom stroom eluens met de injector-passeert en is verbonden met de perifere poort op de inlaat van de kolom. Tijdens de splitsing van de stroom, wordt de vloeistofstroom percentage ingesteld op 40:60 (midden: perifere) voor de leidingen zijn verbonden met de kolom, dwz van injector centrum en pomp perifere.

Twee pompsysteem

De CF kolom vereist twee stromen aan het inlaateinde-fitting van de kolom. Afhankelijk van het type autosampler / Injecteur volgens de HPLC instrument stroomsplitsingsproces zetten niet altijd mogelijk, en dus CF kan dan worden bereikt door 2 pompen (Figuur 3B ²¹⁾. Elke pomp is verdeeld en aangesloten op het centrale of perifere poort en de stroomsnelheid is ingesteld op 40% van de stroom voor de centrale poort en 60% voor periferiepoort vertegenwoordigen. Als bijvoorbeeld de totale stroomsnelheid 1,0 ml min ^-1, de centrale pompdebiet wordt ingesteld op 0,4 ml ^min-1 en de perifere pomp is ingesteld op 0,6 ml min ^-1.

De keuze van de werkwijze is grotendeels afhankelijk van de HPLC instrumentatie en chromatografische werkwijze. Bijvoorbeeld in sommige autosamplers een verandering in druk tussen monster laadpositie en injecteer monster positie kan optreden verstoren van de stroomsplitsingsproces verhouding en dus in dit geval een dubbele pomp ingesteld voor optimale prestaties CF zou worden aanbevolen. Ongeacht het oplosmiddeltoevoersysteem opgezet gekozen voor de inlaat van de kolom CF, CF blijft de uitlaat optimalisatie hetzelfde. De uitlaat centrale poort van de kolom CF is bevestigd aan de Ultraviolet-Visible (UV-Vis) detector met de smalopdat volume mogelijk slang aan de effecten van post-kolom dode volume te minimaliseren. Aangezien CF kolommen emuleren nauwe boring kolommen dode volume tussen de kolomuitlaat en de detector is nadelig voor het scheidend vermogen van de kolom CF. Het is cruciaal om de kleinste hoeveelheid volume buis tussen de centrale poort en de UV-Vis detector om de effecten van dode volume zoals bandverbreding, rendementsverlies en gevoeligheid minimum wordt beperkt. Derhalve wordt het gebruik van smalle boring buis (0,1 mm id) aangeraden gemakkelijk druk aanpassingen mogelijk zonder toevoeging ongepaste dood volume. Slang is ook verbonden met de periferiepoort en gericht te verspillen. Bij de uitlaat van de kolom CF, kan de segmentering verhouding worden aangepast aan elke verhouding die het doel van de analist past. Wanneer een 4,6 mm id CF wordt gebruikt, bijvoorbeeld, is het vaak handig om de ratio of 43:57 of 21:79 (centrum: perifere) ingesteld op een "virtueel" 3,0 mm ID kolom of 2,1 mm kolom die emulerenrespectvol. Op die manier de scheiding prestaties is direct-bank gemarkeerd. De segmentatie verhouding wordt gemeten door wegen van de hoeveelheid stroom verlaten van de detector die is verbonden met de centrale poort en de stroom die uit de periferiepoort gedurende een periodetijd. Het percentage stroming door elke poort kan dan worden bepaald en de verhoudingen kunnen worden bijgesteld door het buisstuk bevestigd of via slangen met een andere inwendige diameter (id) heeft.

Deze video protocol beschrijft de procedures van een CF-column voor verbeterde chromatografische prestaties werking en optimalisatie.

Protocol

Let op: Raadpleeg de veiligheidsinformatiebladen (VIB) voor alle materialen en reagentia voor het gebruik (dwz, VIB voor methanol). Zorg ervoor dat het gebruik van alle nodige veiligheidsvoorschriften bij de omgang met oplosmiddelen en High Performance Liquid Chromatography (HPLC) eluent. Zorgen voor het juiste gebruik van technische controles van HPLC, analytische balans en de detector instrumentatie, en zorgen voor het gebruik van persoonlijke beschermingsmiddelen (veiligheidsbril, handschoenen, laboratoriumj…

Representative Results

AFT kolommen werden ontwikkeld met behulp van een gespecialiseerde frit ontwerp (figuur 1) in de multipoort kolom end-fittingen aan de kolom bed heterogeniteit overwinnen en scheiding verbeteren. Een inter-laboratoriumonderzoek op de scheiding prestaties van CF chromatografiekolommen (figuur 2) werd uitgevoerd met een dubbele pomp opgezet (Figuur 3B), zoals beschreven in paragraaf 3 van dit protocol 23 uitgevoerd. Een drie com…

Discussion

Dit onderzoek betrof de inter-laboratoriumanalyse van CF chromatografiekolommen de analytische prestaties in termen van efficiency en gevoeligheid te testen. De CF-kolom werd opgezet met een dubbele pompsysteem zoals beschreven in paragraaf "3. Dubbele pomp opgezet om een ​​stroom van 40:60 bereiken (midden: perifere) aan de inlaatzijde van de kolom CF. Het 40:60 (centrum: perifere) stroomverhouding werd bereikt door het debiet van elke pomp naar de waarde die 40% en 60% van de totale stroomsnelheid, wat overee…

Materials

HPLC instrument
Additional Pump			Required if 2 pump CF system set up is to be used.
Curtain Flow HPLC column	Thermo Fisher Scientific	Not Defined	Soon to be commercialised
Methanol	Any brand		HPLC Grade
PEEK tubing	Any brand		Various lengths and i.d.
PEEK tube cutter	Any brand
Analytical Scale Balance	Any brand
Stop watch	Any brand
Eluent collection vessels	Any brand		1-2 mL Sample vials can be used as eluent collection vessels
T-piece	Any brand