Negli embrioni di Xenopus, le cellule del tetto del blastocele sono pluripotenti e possono essere programmate per generare vari tessuti. Qui, descriviamo i protocolli per utilizzare gli espianti di tetti di blastocele di anfibi come sistema di analisi per studiare le caratteristiche chiave in vivo e in vitro dello sviluppo neurale precoce.
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In questo articolo
Sommario
Abstract
Comprendere i programmi genetici alla base dello sviluppo neurale è un obiettivo importante della biologia dello sviluppo e delle cellule staminali. Nella blastula anfibia, le cellule del tetto del blastocele sono pluripotenti. Queste cellule possono essere isolate e programmate per generare vari tessuti attraverso la manipolazione dell'espressione genica o l'induzione da parte dei morfogeni. In questo manoscritto vengono descritti i protocolli per l'uso di espianti di tetti di blastocele di Xenopus laevis come sistema di analisi per studiare le caratteristiche chiave in vivo e in vitro dello sviluppo neurale precoce. Questi protocolli consentono lo studio dell'acquisizione del destino, dei comportamenti di migrazione cellulare e delle proprietà autonome e non autonome delle cellule. Gli espianti di blastocele possono essere coltivati in un terreno definito privo di siero e innestati in embrioni ospiti. Questo trapianto in un embrione consente di studiare l'impegno a lungo termine del lignaggio, le proprietà induttive e il comportamento delle cellule trapiantate in vivo. Questi saggi possono essere sfruttati per studiare i meccanismi molecolari, i processi cellulari e le reti di regolazione genica alla base dello sviluppo neurale. Nel contesto della medicina rigenerativa, questi saggi forniscono un mezzo per generare tipi di cellule di derivazione neurale in vitro che potrebbero essere utilizzati nello screening dei farmaci.
Introduzione
Il sistema nervoso vertebrato emerge dalla piastra neurale come uno strato omogeneo di cellule neuroepiteliali. Comprendere come sono indotte programmi di sviluppo, codificati, e stabilito durante la regionalizzazione della piastra neurale è, allo stato attuale, un obiettivo importante nella biologia dello sviluppo. Rispetto ad altri sistemi, il sperimentalmente suscettibili di Xenopus embrioni è un modello di riferimento per analizzare i primi passi di sviluppo neurale 1,2. E 'facile ottenere un gran numero di embrioni, e sviluppo esterno dà accesso ai primi passi della neurulazione 3. Molti strumenti sono a disposizione per manipo....
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Protocollo
Gli esperimenti sono conformi alle normativa nazionale ed europea sulla protezione degli animali utilizzati a fini scientifici e con i principi sanciti a livello internazionale di sostituzione, riduzione e perfezionamento.
1. Flat-montaggio Xenopus laevis Girini anteriore del tubo neurale Dopo tutto il montaggio ibridazione in situ
- Ottenere X. laevis embrioni secondo le procedure standard 4 e invecchiare fino a raggiungere neurula palco 26 e più anziani (secondo Nieuwkoop e Faber tavolo di sviluppo 17.
- Fix X. laevis tadpoles incubandoli in una soluzione di 4% p....
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Risultati
Sulla base di considerazioni morfologiche in specie diverse, manipolazioni embriologici, e il pattern di espressione di geni regolatori, un modello concettuale che sostiene la piastra neurale è diviso in segmenti trasversali e longitudinali che definiscono una griglia sviluppo generare campi histogenic distinte. Nel placca neurale, la primordi del prosencefalo, mesencefalo, rombencefalo e del midollo spinale sono tutti già stabilito lungo l'asse antero-posteriore (AP) durante la gast.......
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Discussione
Sviluppo neurale è orchestrata da una complessa interazione tra programmi di sviluppo cellulari e segnali dai tessuti circostanti (Recensito a 3,31,32). Qui si descrive un set di protocolli che possono essere utilizzati in X. laevis embrioni per esplorare fattori estrinseci ed intrinseci coinvolti nella determinazione destino neurale e la morfogenesi neuronale in vitro e in vivo. Questi protocolli possono essere usati come tali X. embrioni tropicalis, tutt.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
L'autore ringrazia Hugo Juraver-Geslin, Marion Wassef e Anne Hélène Monsoro-Burq per il loro aiuto e consiglio, e la Struttura per Animali dell'Institut Curie. L'autore ringrazia Paul Johnson per il suo lavoro di editing sul manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto dal Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS UMR8197, INSERM U1024) e da sovvenzioni dell'"Association pour la Recherche sur le Cancer" (ARC 4972 e ARC 5115; FRC DOC20120605233 e LABEX Memolife) e la Fondation Pierre Gilles de Gennes (FPGG0039).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Paraformaldeide | VWR | 20909.290 | Perle tossiche |
| di resina a scambio anionico | Biorad | 140- 1231 | |
| Albumina sierica bovina | SIGMA | A-7888 | Per la coltura di cappelle animalepH 7,6 |
| Gentamicina | GIBCO | 15751-045 | antibiotico |
| Albumina sierica bovina | SIGMA | A7906 | per la preparazione delle perle |
Riferimenti
- Nieuwkoop, P. D. IIB, Pattern formation in the developing central nervous system (CNS) of the amphibians and birds (English). Proceedings of the Koninklijke Nederlandse Akademie van Wetenschappen. 94, 121-127 (1991).
- Nieuwkoop, P. D.
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Ristampe e permessi
