Konstruktion av Modular hydrogel Skivor för Micropatterned Makro skalas 3D Cellular Architecture

Summary

We describe the fabrication of micropatterned hydrogel sheets using a simple process, which can be assembled and manipulated in a freestanding form. Using these modular hydrogel sheets, a simple macro-scaled 3D cell culture system can be generated with a controlled cellular microenvironment.

Abstract

Hydrogeler kan mönstrade på mikroskala med hjälp av mikroflödes eller micropatterning teknik för att ge en in vivo-liknande tredimensionell (3D) vävnad geometri. De resulterande 3D-hydrogel-baserade cellulära konstruktioner har införts som ett alternativ till djurförsök för avancerade biologiska studier, farmakologiska analyser och organtransplantationer applikationer. Fastän hydrogel-baserade partiklar och fibrer kan lätt tillverkas, är det svårt att manipulera dem för vävnadsrekonstruktion. I den här videon beskriver vi en tillverkningsmetod för micropatterned alginat hydrogel ark, tillsammans med sin församling för att bilda en makroskala 3D cellodlingssystem med en kontrollerad cellulär mikromiljö. Med användning av en dimform av kalcium gelningsmedel, är tunna hydrogelpartiklar ark enkelt genereras med en tjocklek i området av 100 till 200 ^ m, och med precisa micropatterns. Celler kan därefter odlas med den geometriska ledning av hydrogelpartiklarna arken ifristående förhållanden. Dessutom kan hydrogel arken lätt manipuleras med hjälp av en mikropipett med en ände skuren spets, och kan monteras i flerskiktsstrukturer genom att stapla dem med en mönstrad polydimetylsiloxan (PDMS) ram. Dessa modulära hydrogel ark, som kan tillverkas med hjälp av en enkel process, har potentiella tillämpningar av in vitro läkemedelsanalyser och biologiska studier, inklusive funktionella studier av mikro- och makro och vävnadsrekonstruktion.

Introduction

Hydrogeler är särskilt lovande biomaterial, och förväntas vara viktiga i grundläggande biologi, farmakologiska analyser och medicin. ¹ Biofabrication av hydrogel-baserade cellulära konstruktioner har föreslagits för att minska användningen av djurförsök, ^2,3 ersätta transplanterbara vävnader, ⁴ och förbättra cellbaserade analyser. ^5,6 Vatteninnehållande (kolväten) viskoelastiska material (geler) tillåta ett stort antal celler som skall inkapslas och hölls i en byggnadsställning struktur för att styra 3D cellulära mikromiljön. I kombination med ledning av mikroflödes eller micropatterning teknik, kan geometrin av hydrogel konstruktioner styras exakt på cellulär nivå. Hittills har en mängd olika former av hydrogeler, inbegripet partiklar, ^{7 – 9} fibrer, ^{10 – 12} och ark, ^{13 – 15} har använts som byggnadsenheter i nedifrån och upp lämpvärk till tillverkning av makroskale flercelliga arkitekturer.

Båda hydrogel-partiklar och fibrer har varit lätt och snabbt framställt för applikationer som mikroskala cellulära miljöer, med fluid kontroller med hjälp av mikroflödessystem enheter. Eftersom de grundläggande enheterna i tekniska vävnader, skulle det vara komplicerat att ordna dem och för att förstora sin volym som makro skala konstruktioner. ¹⁶ Det är svårare att uppnå makro skalas konstruktioner än att producera mikronstorlek basmoduler. Arkliknande enheter av hydrogel-baserade konstruktioner kan användas för att öka volymen av byggnadsställningar via en enkel monteringsprocess. Följdriktigt, staplade lager av hydrogel ark ger inte bara en volymökning men också en geometrisk förlängning i en 3D-rymd.

Vi har tidigare rapporterat en metod för tillverkning av micropatterned hydrogel blad, ^13-15 tillsammans med sin församling i multi-layställda cellulära arkitekturer. Tekniken möjliggör komplexa micropatterning och modulär design av cellulära konstruktioner via en stapling processen med flerskiktsstrukturer. Genom tillverkning av staplade modul hydrogel ark, som Micropatterned, kan en 3D cellodlingssystem med en kontrollerad makroskala cellulära mikro realiseras. Denna video protokoll beskriver ett enkelt men kraftfullt tillverkningsmetod som kan användas för att konstruera modulära hydrogel ark, baserat på den mänskliga levercancer cellinje (HepG2). Vi visar här enkel manipulering av dessa mönstrade modulära hydrogel blad och deras montering i en flerskiktsstruktur.

Protocol

1. Beredning av Micropatterned Formar och Hydrogeler Ge de önskade mikroskalmönster med användning av SU-8 fotoresist på ytan av en kiselskiva via en vanlig två-steg fotolitografisk teknik 15,17 för gjutning PDMS formar. Det visade exemplet använder en lever lob-liknande nätmönster (Figur 1). Väg upp PDMS och en härdarlösning med ett förhållande av 1: 5 (dvs 12,5 g PDMS och 2,5 g av härdare). Blanda 15 g av lösningen noggrant, degas bubb…

Representative Results

Vi har beskrivit tillverkning och manipulation av fristående cellulära hydrogel ark. Såsom visas i fig 1, fabricerade vi micropatterned PDMS formar, och cellinnehållande hydrogelen laddades på den hydrofila ytan av dessa formar och tvärbunden med användning av en luftfuktare för att generera en aerosoliserad dimma av gelningsmedel. Efter utsläpp från formarna, HepG2-celler odlades i fristående hydrogel ark med olika mönster (Figur 2)….

Discussion

Detta protokoll ger en enkel metod för tillverkning av modul hydrogel ark, och sammanföra dem att bilda 3D cellulära ställningar.

För att konstruera tydliga mönstrade alginat strukturer på kort tid, bör vi identifierar en tvärbindningsprocess som kan skapa tillräckligt rigida strukturer för att bibehålla de komplexa micropatterns från formen, samt upprätthålla cellviabiliteten och metabolism. Vi har utvecklat en tvärbindningsprocess, innefattande ett sol-gel-övergång, för …

Materials

Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning Corporation	000000000001064291
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443	Powdered nonionic surfactant
Alginic acid sodium salt, low viscosity	Alfa Aesar	B25266
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	C7902
Ultrasonic humidifier	MediHeim	MH-2800	Modified equipment, Maximum sprayed rate: 250 mL/h
Nylon net filter hydrofilic, 180 μm	EMD Millipore	NY8H04700
Polycarbonate mold			Customized mold for fabrication of a PDMS frame pattern