En semi-automatisert tilnærming til Klar Antistoff Cocktails for Immunophenotypic analyse av perifert blod
Summary
Whole blood Immunophenotyping is indispensable for monitoring the human immune system. However, the number of reagents required and the instability of specific fluorochromes in premixed cocktails necessitates daily reagent preparation. Here we show that semi-automated preparation of staining antibody cocktail helps establish reliable immunophenotyping by minimizing variability in reagent dispensing.
Abstract
Immunfenotyping fra perifert blod ved flow-cytometri bestemmer forandringer i frekvens og aktiveringsstatusen til perifere leukocytter under sykdom og behandling. Det har potensiale til å forutsi terapeutisk effekt og identifisere nye terapeutiske mål. Fullblod farging benytter umanipulerte blod, noe som minimerer gjenstander som kan oppstå under tillagingen. Imidlertid må fullblod flekker også gjøres på ferskt oppsamlet blod for å sikre integriteten av prøven. I tillegg er det best å forberede antistoff cocktails på samme dag for å unngå potensiell ustabilitet i tandem-fargestoffer og forhindre reagent samspillet mellom strålende fiolette fargestoffer. Derfor krever fullblod flekker forsiktig standardisering for å kontrollere for intra og inter-eksperimentell variabilitet.
Her rapporterer vi utplassering av en automatisert væskebehandler utstyrt med en to-dimensjonale (2D) strekkodeleser til en standard prosessen med å lage antibody cocktailer for flowcytometri. Antistoffer ble overført til 2D strekkode rør anordnet i et 96-brønners format og deres innhold samles i en database. Væsken handler da kunne lokalisere kilden antistoff ampullene ved å referere til antistoff navn i databasen. Vår metode eliminert langtekkelig koordinering for plassering av kildeantistoff rør. Det ga allsidighet slik at brukeren kan enkelt endre en rekke detaljer i antistoffdispensering prosess som spesifikt antistoff å bruke, volum, og målet ved å endre databasen uten å skrive om scripting i programvaren metode for hver analyse.
Et bevis for forsøket oppnådd fremragende inter og intra- assay presisjon, demonstrert av replikere utarbeidelse av en 11-farge, 17-antistoff flowcytometri analyse. Disse metoder økte den totale gjennomstrømningen for flowcytometri analyser og tilrettelagt daglig utarbeidelse av komplekse antistoff cocktails som kreves for detaljert phenotypic karakterisering av nystekte samlet antikoagulert perifert blod.
Introduction
Immunfenotyping av humant perifert blod bestemmer kvantitative og kvalitative endringer i immuncelle undergrupper 1. Det gir innsikt i virkningsmekanismer og motstand, hjelpemidler oppdagelsen av prediktive biomarkører, og legger til rette for utvikling av kombinasjonsimmunterapi. Derfor er validering og standardisering av immunfenotyping et område med betydelig interesse for akademiske forskere, kliniske laboratorier og industri.
Selv immunfenotyping av perifert blod ved flowcytometrisk metoder brukes i dag for klinisk behandling av hematologiske maligniteter 2,3 og humant immunsviktvirus (HIV) infeksjon 4,5, pålitelig immunfenotyping av perifert blod for immunterapi krav spesielle hensyn i validering og standardisering fordi det krever mer omfattende dekning over immun celle undergrupper og aktiverings / hemmende reseptorer 1,6-8. successful immunfenotyping krever nøye standardisering for å minimere eksperiment til eksperiment variasjon relatert til instrumentoppsett og cellefarging prosedyren 9,10. Mens standardisering av instrumentinnstillinger for flowcytometri er godt etablert for å møte den tidligere bekymring 9,11,12, er det fortsatt uklart hvordan å minimere variasjon relatert til cellefarging uten å begrense dekningen av immuncelle undergrupper og deres aktiveringsstatus.
Ettersom antallet av antigener som skal påvises øker, så gjør også mulighet for feil og variasjoner på grunn av suboptimal reagens dispensering og krysskontaminering. Metoder for phenoptypic analyse av antikoagulert helblod ble etablert på slutten av 1980-årene for bruk i kliniske laboratorieanalyser. De samme metodene tjene behovene til forskningslaboratoriet for prøveopparbeidelse. Viktigere, antistoff cocktails som brukes i klinisk laboratorium er vanligvis mindre kompleks og available pre-titered og ferdigblandet fra produsenten. Bare en enkelt overføring av de pre-blandede antistoff-cocktail er nødvendig. I forsknings innstillingen antistoff cocktails av 10-16 antistoffene er typiske. Hver cocktail må godkjennes for stabilitet ved laboratoriet eller forberedt frisk før hver analyse. Forbereder flere antistoff cocktails for en prøve kan medføre pipettering av 50-80 individuelle antistoffer, en oppgave som er både kjedelig og feil utsatt.
Automatisering av cocktail preparat har flere fordeler fremfor manuell cocktail preparat som for eksempel færre feil, øket nøyaktighet av pipettering, og muligens til og med redusert reagens svinn. Her rapporterer vi en vellykket innføring av en automatisert væskebehandler utstyrt med en to-dimensjonale (2D) strekkodeleser inn i cellen-farging prosessen med immunfenotyping å redusere variabiliteten relatert til prøveopparbeidelse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Immunfenotyping av perifert blod er kritisk viktig for å få innsikt i individuelle svar til immunterapi. Utfordringen ligger i analyse standardisering for å kontrollere eksperiment til eksperiment variabilitet 1,14. En hovedkilde til variabilitet ligger i den menneskelige manipulering av prøver. Derfor kan det tenkes at delvis eller full automatisering av utvalgets behandling vil legge til rette for en dramatisk reduksjon i eksperiment-til-eksperiment variabilitet 1,14. I denne protokollen, rapporterer vi vår vellykkede forsøk på å minimere assay variasjonen ved å innføre en automatisert væskebehandler utstyrt med 2D strekkodeleser for prøvefarging i fullblod immunfenotyping.
I design, er vår metode allsidig og kan overvåke andre immun undergrupper ved å legge til ekstra "Base Cocktails" for å definere dem. Slike undergrupper omfatter T-hjelperceller, T regulatoriske celler, B-celler, NK-celler, dendrittiske celler, og monocytter (manuskript iforberedelse) 18. Vi tilpasset konsortiets anbefalte antistoff paneler ved å innføre ytterligere en markører. Cellepopulasjoner ble identifisert ved hjelp av "Base Cocktail" konjugert til fluorokromer med minimal utslipp til strålende fiolette 421 (BV421), fysoerytrin (PE), og allofykocyanin (APC) detektorer, som vi ønsket å reservere disse kanalene for påvisning av induserbare antigener. Denne funksjonen sikrer ikke bare den høyeste følsomheten å overvåke aktiveringsstatusen til immunceller, men gjør det også fleksible rom for nye aktiverings markører som disse tre fluorokromer oftest konjugert med antistoffer mot induserbare markører. Derfor er foreliggende fremgangsmåte ikke bare er egnet for fremstilling cocktail for helblod immunfenotyping men er også nyttig for farging av andre prøver, inkludert perifere blodmononukleære celler og celler gjenvunnet fra disaggregert vev (for eksempel tumor).
vellykket introduksjon av vår metode krever spesiell oppmerksomhet til trinn i laboratorie-forberedelser, og programmering og gjennomføring av metoden. Utarbeidelse av 2D strekkode rør inkluderer merking med lesbar etiketter og overføring av antistoffer mot de utpekte rør. For å hindre innføring av feil, anbefaler vi å gjøre dette med to personer. Når du endrer regneark, bør etterforskere verifisere om metoden fungerer riktig. Velge passende pipettering metoder under programmering sikrer vellykket væskeoverføring. LLS muliggjør pipettering uten å få utfelt rusk fra bunnen av antistoff rør, som vi bruker enten P50 eller P200 ledende tips. LLS kan ikke være et godt alternativ for P1000 tips som LLS er mer følsom med P1000 tips og noen ganger feilaktig utløst av tilstedeværelsen av bobler. Høyder i laboratorie definisjon må justeres for hvert instrument som suboptimal væskeoverføring kan forekomme, for eksempel hvis det ikke er nok plass mellom kanten av tipsog bunnen av rørene. Som vist i figur 12, hvis "Base Cocktail" og / eller "Activation Cocktail" ikke ble virvlet godt, kan det resultere i suboptimal farging.
Vi tenkte på å bruke frysetørkede reagenser for cellefarging som et alternativ tilnærming til å redusere variabiliteten relatert med reagens dispensering 19. Men polymer konjugater av strålende fiolette fargestoffer kjent for å samhandle med hverandre forårsaker uspesifikke signaler. Som sådan, legger mer enn to polymer konjugater (f.eks BV421 og BV650 etc.) i frysetørkede reagenser kan forårsake uspesifikke signal (f.eks økning på BV650 bakgrunn signal i BV421 + befolkningen) 20. Videre lyofiliserte reagenser mangler fleksibilitet for å inkludere nye flekker. De er vanligvis mer kostbare og krever et parti. For disse grunner, valgte vi å bruke automatisert væskebehandler utstyrt med 2D-strekkode rør. Selv om det tAKES tid å sette opp og innebærer en investering på forhånd for å kjøpe instrumentet, i det lange løp slike faktorer vil bli kompensert av økt produktivitet og reproduserbarhet av analyser. Faktisk noen grupper tidligere rapportert vellykket integrering av automatisert væskebehandler i arbeidsflyten av immunfenotyping eller lignende programmer 21,22. Automatiserte løsninger for flowcytometri analyse er også tilgjengelig fra kommersielle kilder (FACS SPA III, Automated Cocktail Forberedelse Workstation, og FlowStainer). Dette indikerer videre er det et stort behov for automatisert cocktail forberedelse for immunfenotyping.
Etter å mestre denne teknikken, ser vi at utviklingen av helautomatisk fullblod immunfenotyping vil ytterligere redusere eksperiment til eksperiment variabilitet og kan gjøre fullblod immunfenotyping bart selv i en multisenter klinisk studie innstilling 23. Vi har allerede begynt å bruke en lyse varh assistent til å automatisere lysis og vasketrinn. Vi ser også at automatisert bestemmelse av volumet av antistoff i 2D strekkode rørene og sporing av reagenset utleverings vil i stor grad forbedre opptelling av antistoffer og kvalitetskontrollen over vår fremgangsmåte, henholdsvis.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Hannah Puzas for assistance with system design and configuration, and Kevin Khovananth for technical advice. Funding for this work was provided by The Hearst Foundations and the Providence Portland Medical Foundation.
Materials
| BD LSRFortessa | BD Biosciences | Flow cytometer | |
| NXp Span-8 Laboratory Automation Workstation | Beckman Coulter | A31839 | Laboratory Automation Workstation |
| Insert, Tube, 11 mm, White, for 1.5 mL Microfuge Tubes (case of 25) | Beckman Coulter | 373696 | Accessary for 24-Position Tube Rack to accommodate microfuge tubes. |
| LLS kit | Beckman Coulter | 719262 | Attach bottom of the deck in Laboratory Automation Workstation to enable liquid level sensing |
| 24-Position Tube Rack | Beckman Coulter | 373661 | Tube rack to hold microfuge tubes for antibody cocktails or blood |
| BIOHAZARD AUTOCLAVE BAGS 12×24 IN. RED | LabMart | M111416 | Disposable autoclave bags for the Laboratory Automation Workstation |
| VisionMate High Speed 2D Barcode Reader | Thermo Scientific | AB-1850 | 2D barcode reader |
| 8-Channel Handheld Screw Cap Capper/Decapper | Thermo Scientific | 4105MAT | For de-capping and capping 2D barcode tubes |
| Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-335 | For making cocktail in or supplying blood speciment to the Laboratory Automation Workstation |
| CoolRack XT CFT24 | biocision | BCS-534 | To hold sample tubes. |
| 1.0 mL Matrix ScrewTop Amber Tubes in Latch Racks | Thermo Scientific | 3741AMB | 2D barcode tubes to store fluorescent dye-cojugated antibodies |
| Biomek Span-8 P1000 Tips, Conductive, Pre-sterile with Barrier, 1025 µL | Beckman Coulter | 987925 | Tips for Laboratory Automation Workstation |
| Biomek Span-8 P50 Tips, Conductive, Pre-sterile with Barrier, 50 µL (Case of 10 racks) | Beckman Coulter | B01091 | Tips for Laboratory Automation Workstation |
| Biomek Span-8 P250 Tips, Conductive, Pre-sterile with Barrier (Case of 10 racks) | Beckman Coulter | 394627 | Tips for Laboratory Automation Workstation |
| BD FACS Lysing Solution 10X Concentrate | BD Biosciences | 349202 | RBC lysis |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes | Fisher Scientific | 14-959-5 | Sample tubes |
| Anti-CD45 FITC | BD Biosciences | 347463 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-CD3 Alexa Fluor 700 | eBioscience | 56-0038-42 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-CD4 PerCPCy5.5 | BD Biosciences | 341654 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-TCRgd BV650 | BD Biosciences | 564156 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-TCRab BV786 | BD Biosciences | 563825 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-CD8 APC-H7 | BD Biosciences | 560179 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-CCR7 PE-CF594 | BD Biosciences | 562381 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-CD45RA PE-Cy7 | BD Biosciences | 337167 | Effector T cell panel (base) |
| Anti-HLA-DR BV421 | BD Biosciences | 562804 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD278(ICOS) PE | BD Biosciences | 557802 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD38 APC | BD Biosciences | 340439 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD279(PD1) BV421 | BD Biosciences | 562516 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD357(GITR) PE | eBioscience | 12-5875-42 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD137(41BB) APC | BD Biosciences | 550890 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD69 BV421 | BD Biosciences | 562884 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD314(NKG2D) PE | BD Biosciences | 557940 | Effector T cell panel (activation) |
| Anti-CD134(OX40) APC | BioLegend | 350008 | Effector T cell panel (activation) |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with Sodium Heparin: Conventional Stopper | Fisher Scientific | 02-689-6 | For collecting blood |
| Albumin, Bovine Serum, Fraction V, RIA and ELISA Grade | EMD Millipore | 126593 | For flow wash buffer |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S8032 | For flow wash buffer |
| Heparin, sodium salt | Affimetrix | 16920 | For flow wash buffer |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS), 1X, with Calcium, Magnesium, without Phenol Red | GE Healthcare Life Sciences | SH30588.02 | For flow wash buffer |
Riferimenti
- Maecker, H. T., McCoy, J. P., Nussenblatt, R. Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project. Nat. Rev. Immunol. 12 (3), 191-200 (2012).
- Craig, F. E., Foon, K. A. Flow cytometric immunophenotyping for hematologic neoplasms. Blood. 111 (8), 3941-3967 (2008).
- Johansson, U., Bloxham, D., et al. Guidelines on the use of multicolour flow cytometry in the diagnosis of haematological neoplasms. Br. J. Haematol. 165 (4), 455-488 (2014).
- Schnizlein-Bick, C. T., Spritzler, J., et al. Evaluation of TruCount Absolute-Count Tubes for Determining CD4 and CD8 Cell Numbers in Human Immunodeficiency Virus-Positive Adults. Clin. Vaccine Immunol. 7 (3), 336-343 (2000).
- Cossarizza, A., De Biasi, S., et al. Cytometry, immunology, and HIV infection: Three decades of strong interactions. Cytometry A. 83 (8), 680-691 (2013).
- Hensley, T. R., Easter, A. B., et al. Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay. J. Vis. Exp. (67), e4302 (2012).
- Streitz, M., Miloud, T., et al. Standardization of whole blood immune phenotype monitoring for clinical trials: panels and methods from the ONE study. Transplant. Res. 2 (1), 17 (2013).
- Hensley-McBain, T., Heit, A., De Rosa, S. C., McElrath, M. J., Andersen-Nissen, E. Optimization of a whole blood phenotyping assay for enumeration of peripheral blood leukocyte populations in multicenter clinical trials. J. Immunol. Methods. 411, 23-36 (2014).
- Green, C. L., Brown, L., Stewart, J. J., Xu, Y., Litwin, V., Closkey, T. W. M. Recommendations for the validation of flow cytometric testing during drug development: I instrumentation. J. Immunol. Methods. 363 (2), 104-119 (2011).
- O’Hara, D. M., Xu, Y., Liang, Z., Reddy, M. P., Wu, D. Y., Litwin, V. Recommendations for the validation of flow cytometric testing during drug development: II assays. J. Immunol. Methods. 363 (2), 120-134 (2011).
- Owens, M. A., Vall, H. G., Hurley, A. A., Wormsley, S. B. Validation and quality control of immunophenotyping in clinical flow cytometry. J. Immunol. Methods. 243 (1-2), 33-50 (2000).
- Kalina, T., Flores-Montero, J., et al. EuroFlow standardization of flow cytometer instrument settings and immunophenotyping protocols. Leukemia. 26 (9), 1986-2010 (2012).
- Calvelli, T., Denny, T. N., Paxton, H., Gelman, R., Kagan, J. Guideline for flow cytometric immunophenotyping: a report from the National Institute of Allergy and Infectious Diseases, Division of AIDS. Cytometry A. 14 (7), 702-715 (1993).
- Biancotto, A., McCoy, J. P. Studying the human immunome: the complexity of comprehensive leukocyte immunophenotyping. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 377, 23-60 (2014).
- Perfetto, S. P., Ambrozak, D., Nguyen, R., Chattopadhyay, P., Roederer, M. Quality assurance for polychromatic flow cytometry. Nat. Protoc. 1 (3), 1522-1530 (2006).
- Yong, P. F. K., Salzer, U., Grimbacher, B. The role of costimulation in antibody deficiencies: ICOS and common variable immunodeficiency. Immunol. Rev. 229 (1), 101-113 (2009).
- Donnenberg, A. D., Donnenberg, V. S. Rare-Event Analysis in Flow Cytometry. Clin. Lab. Med. 27 (3), 627-652 (2007).
- Biancotto, A., Fuchs, J. C., Williams, A., Dagur, P. K., McCoy, J. P. High dimensional flow cytometry for comprehensive leukocyte immunophenotyping (CLIP) in translational research. J. Immunol. Methods. 363 (2), 245-261 (2011).
- Villanova, F., Di Meglio, P., et al. Integration of Lyoplate Based Flow Cytometry and Computational Analysis for Standardized Immunological Biomarker Discovery. PloS One. 8 (7), e65485 (2013).
- BD biosciences. . Optimizing Experiments Using BD Horizon Brilliant Polymer Conjugates. , (2014).
- Malergue, F., van Agthoven, A., Scifo, C., Egan, D., Strous, G. J. Automation of a Phospho-STAT5 Staining Procedure for Flow Cytometry for Application in Drug Discovery. J. Biomol. Screen. 20 (3), 416-421 (2015).
- Hasan, M., Beitz, B., et al. Semi-automated and standardized cytometric procedures for multi-panel and multi-parametric wholeblood immunophenotyping. Clin. Immunol. 157 (2), 261-276 (2015).
- Maecker, H. T., McCoy, J. P., et al. A model for harmonizing flow cytometry in clinical trials. Nat. immunol. 11 (11), 975-978 (2010).
