مراقبة البصرية من الخلايا الحية النشاط الكهربائي من قبل مترافق البوليمرات
Summary
A method for stimulation of in-vitro cell cultures electrical activity with visible light, based on the use of organic semiconducting polymers is described.
Abstract
Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated polymers display several optimal properties as substrates for biological systems, such as good biocompatibility, excellent mechanical properties, cheap and easy processing technology, and possibility of deposition on light, thin and flexible substrates. These materials have been employed for cellular interfaces like neural probes, transistors for excitation and recording of neural activity, biosensors and actuators for drug release. Recent experiments have also demonstrated the possibility to use conjugated polymers for all-optical modulation of the electrical activity of cells. Several in-vitro study cases have been reported, including primary neuronal networks, astrocytes and secondary line cells. Moreover, signal photo-transduction mediated by organic polymers has been shown to restore light sensitivity in degenerated retinas, suggesting that these devices may be used for artificial retinal prosthesis in the future. All in all, light sensitive conjugated polymers represent a new approach for optical modulation of cellular activity.
In this work, all the steps required to fabricate a bio-polymer interface for optical excitation of living cells are described. The function of the active interface is to transduce the light stimulus into a modulation of the cell membrane potential. As a study case, useful for in-vitro studies, a polythiophene thin film is used as the functional, light absorbing layer, and Human Embryonic Kidney (HEK-293) cells are employed as the biological component of the interface. Practical examples of successful control of the cell membrane potential upon stimulation with light pulses of different duration are provided. In particular, it is shown that both depolarizing and hyperpolarizing effects on the cell membrane can be achieved depending on the duration of the light stimulus. The reported protocol is of general validity and can be straightforwardly extended to other biological preparations.
Introduction
إمكانية للتلاعب في النشاط الخلوي مع القرار المكانية والزمانية الدقيق تمثل استراتيجية رئيسية في البحث العلمي العصبي وعلاج الاضطرابات العصبية والنفسية. وتستند 1 الأساليب التقليدية على التحفيز الكهربائي للخلايا باستخدام أقطاب المتمركزة في القرب أو في اتصال مع النظام المستهدف، (2) الذي يمكن أن يكون من تعقيد مختلفة (وحيدة الخلية، الشبكة الخلوية، شرائح الدماغ، في الجسم الحي أنسجة المخ). خلال القرن الماضي، وقد وفرت استخدام التصحيح، المشبك، والمعادن وأقطاب متكاملة الركيزة صورة مفصلة عن علم وظائف الأعضاء والفيزيولوجيا المرضية من الخلايا العصبية واحدة وآليات عمل الشبكات العصبية. ومع ذلك، التحفيز الكهربائي يعاني من القيود الهامة. يرتبط أول من القرار المكانية الفقراء عموما بسبب الأبعاد المادية من الأقطاب الكهربائية والهندسة بهم ثابتة، والتي لا يمكن تكييفه بسهولةنظم نظم معقدة مثل الأنسجة البيولوجية. أيضا، المشاكل المتصلة مقاومة الأقطاب وعبر الحديث بين نظم التحفيز وتسجيل قد تتدهور نسبة النهائية للقياسات إشارة إلى الضوضاء. 3 ومن ناحية أخرى، فإن استخدام الضوء لتحفيز يمكن أن يساعد على التغلب على الكثير من القيود من نهج الكهربائية. أولا وقبل كل شيء، فإنه يوفر المكاني لم يسبق لها مثيل (<1 ميكرون)، والقرار الزماني (<1 ميللي ثانية)، مما يجعل من الممكن لاستهداف أنواع معينة من الخلايا أو حتى حجرات خلية فرعية. وبالإضافة إلى ذلك فمن غاية غير الغازية لأنه يتجنب أي اتصال جسدي مع الأنسجة من الاهتمام والتحفيز disentangles من التسجيل. وعلاوة على ذلك، سواء شدة الضوء والطول الموجي يمكن أن تنظم بدقة وبروتوكولات التحفيز بالتالي المتنوعة يمكن تطبيقها. 3،4
ومع ذلك، فإن الغالبية العظمى من الخلايا الحيوانية لا تقدم أي حساسية معينة للضوء. عدة استراتيجيات لstimulatio البصريةن وبالتالي تم اقتراح، إما استغلال الوسطاء الجزيئية الحساسة للضوء في مكان قريب أو داخل الخلايا، أو باستخدام جهاز متفاعل وضعها خارجيا، على مقربة من الخلية. تشير الفئة الأولى إلى الآليات الذاتية مثل التحفيز عن طريق مرئية أو الأشعة تحت الحمراء (IR) الضوء، فضلا عن استخدام أي مركبات photoisomerizable / photocleavable أو التعبير الجيني للالمحركات الجزيئية للضوء (optogenetics). وتشمل الفئة الأخيرة التقنيات لتحفيز خارجي يتحقق مع استخدام غير العضوية نانو / الجسيمات الدقيقة أو ركائز السيليكون ضوئية. 5 ومع ذلك، كل هذه النظم والجوانب المشرقة وعيوب. على وجه الخصوص، وامتصاص الذاتية للخلايا في المدى المنظور ضعيفة ولا يمكن الاعتماد عليها، والجيل يصاحب ذلك من أنواع الاكسجين التفاعلية قد تكون ضارة إلى الخلية. بشكل عام، يتم استخدام الأشعة تحت الحمراء لإحداث التسخين الحراري المحلية بسبب امتصاص الماء، ولكن معامل انقراض المياه الصغيرة، مما يتطلب الحاديرونغ ضوء الأشعة تحت الحمراء (من عشرات إلى مئات W / مم 2) يصعب تسليم عبر البصريات المجهر القياسية ويمكن أن تشكل مخاوف تتعلق بالسلامة للتطبيقات في الجسم الحي. من ناحية أخرى، مركبات حبس-صور للتحويل لديها إجراءات محدودة الوقت، وغالبا ما تتطلب ضوء الأشعة فوق البنفسجية التي يصعب تسليم نظرا لاختراق الأنسجة محدودة. إضافة إلى أنها تعاني من مشاكل انتشار المركبات تفعيلها على التحلل الضوئي خارج المنطقة المضاءة. وأخيرا، قد سمحت أدوات optogenetic العلماء لاستهداف الفئات السكانية الخلوية محددة ومحصورة الفرعية والناشئة بسرعة باعتبارها واحدة من التكنولوجيات الرئيسية في البحث العلمي العصبي. ومع ذلك، وإدراج شريحة الحمض النووي الخارجية عبر ناقلات فيروسية يثير قضايا هامة تتعلق بالسلامة، لا سيما في ضوء اعتماد على المرضى من البشر. 5،6 لهذه الأسباب، والبحث عن المواد والأجهزة الجديدة قادرة على خلية التلاعب البصري هو موضوع ساخن للغاية.
في الآونة الأخيرة، رواية، وقد اقترح النهج القائم على استخدام البوليمرات مترافق حساسة للضوء، وقادرة على تنبيغ حافزا البصرية بكفاءة في التشكيل من النشاط الكهربائي الخلية. وتحفيز الخلية التي كتبها بوليمر Photoexcitation (CSPP) تقنية تستغل العديد من الميزات تمكين مفتاح نموذجية من أشباه الموصلات العضوية: فهي حساسة في جوهرها إلى النور في المدى المرئي (7)؛ فهي حيويا، لينة ومطابق ومرونتها الميكانيكية يسمح واجهة الحميمة مع النسيج على حد سواء في المختبر والمجراة 10/08. بغض النظر عن ذلك، فإنها يمكن أن functionalized بسهولة إلى التكيف بشكل أفضل مع واجهة مع الخلايا الحية، وتمكين الإثارة محددة، تحقق والاستشعار القدرات. 11،12 وعلاوة على ذلك، فإنها تدعم الإلكترونية وكذلك النقل الأيونية، مما يجعلها مثالية لمزيج البيولوجيا الإعلانية الإلكترونية. 13،14 ومن المثير للاهتمام، وأنها يمكن أن تعمل في وضع الضوئية، وتجنب الحاجة إلى تطبيق التحيز و الخارجية15 أو التحفيز البصري خلية فعالة.
وقد موثوقية تقنية CSPP سابقا تظاهروا في العديد من النظم، بما في ذلك الخلايا العصبية الأولية، 15،16 النجمية، 17 خطوط الخلايا الثانوية 18 والأنسجة الشبكية explanted. 16 في هذا العمل، وجميع الخطوات اللازمة لافتعال حساسة للضوء والحيوية والبوليمر ووصف واجهة 19 لتحفيز البصري نظم في المختبر بالتفصيل. كحالة دراسة، والعضوية مزيج الضوئية نموذج أولي من الإقليم العادية بولي (3-hexylthiophene) (ص ص-P3HT)، يعمل بوصفه المانحة الإلكترون، واستر فينيل-C61-زبدي، حمض الميثيل (PCBM)، بوصفها ويعمل متقبل الإلكترون. كما النظام البيولوجي، وتستخدم الجنينية البشرية الكلى (HEK-293) الخلايا. وأعطى مثالا على بروتوكول ضوئي مع تسجيل النسبي للنشاط الخلايا عن طريق القياسات الكهربية.
منصة وصفغير أنه من صحة العامة، وأنها يمكن أن تمتد بسهولة إلى استخدام البوليمرات مترافق أخرى (عن طريق ضبط عملية الحل إعداد والمعلمات ترسب بشكل صحيح)، وأنواع مختلفة من الخلايا (عن طريق تغيير بشكل صحيح بروتوكول زراعة الخلايا، والطلاء الداخلي والوقت المطلوب لبذر الخلايا وانتشار) والبروتوكولات التحفيز المختلفة (ضوء الطول الموجي والتردد محفزات ومدة وكثافة photoexcitation).
Protocol
Representative Results
Discussion
خطوات حاسمة من البروتوكول ذكرت لتحفيز البصري للخلايا تتعلق بشكل رئيسي في المختبر اختيار البوليمر حساسة للضوء، والمعلمات التعقيم الحراري، وشدة ومدة المنبهات الخفيفة. تم اختيار الفيلم PCBM رقيقة هنا، لأنه يضمن الاستقرار الزماني والكهروكيميائية جيدة: A P3HT. وم?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The work was supported by EU through project FP7-PEOPLE-212-ITN 316832-OLIMPIA,
Telethon – Italy (grants GGP12033 and GGP14022), Fondazione Cariplo (grant ID 2013-0738).
Materials
| rr-P3HT | Sigma Aldrich | 698989-5G | |
| ITO-coated substrates | Nano-CS | IT10300100 | |
| Fibronectin | Sigma Aldrich | F1141 | |
| chlorobenzene | Sigma Aldrich | 319996 | |
| PCBM | Nano-C | Nano-CPCBM-BF | |
| acetone | Sigma Aldrich | 270725 | |
| isopropyl alcohol | Sigma Aldrich | 563935 | |
| HEK cells | LGC standards srl | ATCC-CRL-1573 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H0887 | |
| PBS | Sigma Aldrich | P5244 | |
| E-MEM | LGC standards srl | ATCC-30-2003 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E8008- | |
| FBS | LGC standards srl | ATCC-30-2020 |
Riferimenti
- Alivisatos, A. P., et al. Nanotools for Neuroscience and Brain Activity Mapping. ACS Nano. 7 (3), 1850-1866 (2013).
- Spira, M. E., Hai, A. Multi-electrode array technologies for neuroscience and cardiology. Nat. Nanotechnol. 8 (2), 83-94 (2013).
- Scanziani, M., Häusser, M. Electrophysiology in the age of light. Nature. 461 (7266), 930-939 (2009).
- Bareket-Keren, L., Hanein, Y. Novel interfaces for light directed neuronal stimulation: advances and challenges. Int. J. Nanomed. 9 (1), 65-83 (2014).
- Antognazza, M. R., et al. Shedding Light on Living Cells. Adv. Mater. , (2014).
- Martino, N., Ghezzi, D., Benfenati, F., Lanzani, G., Antognazza, M. R. Organic semiconductors for artificial vision. J. Mater. Chem. B. 1 (31), 3768-3780 (2013).
- Antognazza, M. R., Scherf, U., Monti, P., Lanzani, G. Organic-based tristimuli colorimeter. Appl. Phys. Lett. 90 (16), 163509 (2007).
- Liao, C., Zhang, M., Yao, M. Y., Hua, T., Li, L., Yan, F. Flexible Organic Electronics in Biology: Materials and Devices. Adv. Mater. , (2014).
- Khodagholy, D., et al. NeuroGrid: recording action potentials from the surface of the brain. Nat. Neurosci. 18 (2), 310-315 (2015).
- Campana, A., et al. Electrocardiographic Recording with Conformable Organic Electrochemical Transistor Fabricated on Resorbable Bioscaffold. Adv. Mater. 26 (23), 3874-3878 (2014).
- Bonetti, S., et al. A Lysinated Thiophene-Based Semiconductor as a Multifunctional Neural Bioorganic Interface. Adv. Healthc. Mater. , (2015).
- Benfenati, V., et al. A transparent organic transistor structure for bidirectional stimulation and recording of primary neurons. Nat. Mater. 12 (7), 672-680 (2013).
- Rivnay, J., Owens, R. M., Malliaras, G. G. The Rise of Organic Bioelectronics. Chem. Mater. 26 (1), 679-685 (2014).
- Pires, F., et al. Neural stem cell differentiation by electrical stimulation using a cross-linked PEDOT substrate: Expanding the use of biocompatible conjugated conductive polymers for neural tissue engineering. BBA-Gen. Subjects. 1850 (6), 1158-1168 (2015).
- Ghezzi, D., et al. A hybrid bioorganic interface for neuronal photoactivation. Nat. Commun. 2 (166), 1-7 (2011).
- Ghezzi, D., et al. A polymer optoelectronic interface restores light sensitivity in blind rat retinas. Nat. Photonics. 7 (5), 400-406 (2013).
- Benfenati, V., et al. Photostimulation of Whole-Cell Conductance in Primary Rat Neocortical Astrocytes Mediated by Organic Semiconducting Thin Films. Adv. Healthc. Mater. 3 (3), 392-399 (2014).
- Martino, N., et al. Photothermal cellular stimulation in functional bio-polymer interfaces. Sci. Rep. 5 (8911), (2015).
- Antognazza, M. R., Ghezzi, D., Musitelli, D., Garbugli, M., Lanzani, G. A hybrid solid-liquid polymer photodiode for the bioenvironment. Appl. Phys. Lett. 94 (24), 243501 (2009).
- . Essentials of Neuroscience. Patch Clamp Electrophysiology. JoVE Science Education Database. , (2015).
- Scarpa, G., Idzko, A. L., Götz, S., Thalhammer, S. Biocompatibility Studies of Functionalized Regioregular Poly(3-hexylthiophene) Layers for Sensing Applications. Macromol. Biosci. 10 (4), 378-383 (2010).
- Bellani, S., et al. Reversible P3HT/Oxygen Charge Transfer Complex Identification in Thin Films Exposed to Direct Contact with Water. J. Phys. Chem. C. 118 (12), 6291-6299 (2014).
- Wells, J., et al. Optical stimulation of neural tissue in vivo. Opt. Lett. 30 (5), 504-506 (2005).
- Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. P., Bezanilla, F. Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance. Nat. Commun. 3 (736), 1-10 (2012).
- Duke, A. R., et al. Transient and selective suppression of neural activity with infrared light. Sci. Rep. 3 (2600), 1-8 (2013).
