Contrôle optique des cellules vivantes activité électrique par conjugués polymères

Summary

A method for stimulation of in-vitro cell cultures electrical activity with visible light, based on the use of organic semiconducting polymers is described.

Abstract

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated polymers display several optimal properties as substrates for biological systems, such as good biocompatibility, excellent mechanical properties, cheap and easy processing technology, and possibility of deposition on light, thin and flexible substrates. These materials have been employed for cellular interfaces like neural probes, transistors for excitation and recording of neural activity, biosensors and actuators for drug release. Recent experiments have also demonstrated the possibility to use conjugated polymers for all-optical modulation of the electrical activity of cells. Several in-vitro study cases have been reported, including primary neuronal networks, astrocytes and secondary line cells. Moreover, signal photo-transduction mediated by organic polymers has been shown to restore light sensitivity in degenerated retinas, suggesting that these devices may be used for artificial retinal prosthesis in the future. All in all, light sensitive conjugated polymers represent a new approach for optical modulation of cellular activity.

In this work, all the steps required to fabricate a bio-polymer interface for optical excitation of living cells are described. The function of the active interface is to transduce the light stimulus into a modulation of the cell membrane potential. As a study case, useful for in-vitro studies, a polythiophene thin film is used as the functional, light absorbing layer, and Human Embryonic Kidney (HEK-293) cells are employed as the biological component of the interface. Practical examples of successful control of the cell membrane potential upon stimulation with light pulses of different duration are provided. In particular, it is shown that both depolarizing and hyperpolarizing effects on the cell membrane can be achieved depending on the duration of the light stimulus. The reported protocol is of general validity and can be straightforwardly extended to other biological preparations.

Introduction

La possibilité de manipuler l'activité cellulaire avec une résolution spatiale et temporelle précise représente une stratégie importante dans la recherche neuroscientifique et dans le traitement de troubles neurologiques et psychiatriques. ¹ Les méthodes traditionnelles sont basés sur la stimulation électrique des cellules en utilisant des électrodes positionnées à proximité ou en contact avec le système cible, ² qui peut être différent de complexité (cellule unique, le réseau cellulaire, des tranches de cerveau, in vivo des tissus cérébraux). Au cours du siècle passé, l'utilisation de patch-clamp, le métal et les électrodes de substrat intégré ont fourni une image détaillée de la physiologie et la physiopathologie de neurones simples et des mécanismes de réseaux de neurones de fonctionnement. Toutefois, la stimulation électrique souffre de limitations importantes. Le premier est lié à une résolution spatiale généralement médiocre en raison des dimensions physiques des électrodes et leur géométrie fixe, ce qui ne peut pas être facilement adaptésà des systèmes organisés complexes comme les tissus biologiques. En outre, les problèmes liés à l'impédance des électrodes et de diaphonie entre les systèmes de stimulation et d'enregistrement peuvent se détériorer le rapport signal final à bruit des mesures. ³ D'autre part, l'utilisation de la lumière pour la stimulation peut aider à surmonter de nombreuses limitations de l'approche électrique. Tout d'abord, elle offre sans précédent spatiale (<1 um) et la résolution temporelle (<1 ms), ce qui permet de cibler des types cellulaires spécifiques, voire des compartiments sub-cellulaires. En outre, il est hautement non invasif car il évite tout contact physique avec le tissu d'intérêt et se démêlent stimulation de l'enregistrement. En outre, à la fois l'intensité lumineuse et la longueur d'onde peuvent être précisément réglementés et protocoles de stimulation ainsi diverses peuvent être appliquées. ^3,4

Cependant, la grande majorité des cellules animales ne présentent aucun sensibilité particulière à la lumière. Plusieurs stratégies pour stimulatio optiquen ont donc été proposées, soit l'exploitation de médiateurs moléculaires sensibles à la lumière à proximité ou à l'intérieur des cellules, ou en utilisant un dispositif photosensible placé à l'extérieur, à proximité de la cellule. La première catégorie se réfère aux mécanismes endogènes comme la stimulation par l'intermédiaire (IR) lumière visible ou infrarouge, ainsi que l'utilisation soit de composés photoisomérisables / photoclivable ou l'expression génétique des actionneurs moléculaires photosensibles (optogénétique). Cette dernière catégorie comprend les techniques de stimulation exogène obtenue avec l'utilisation de nano / micro-particules inorganiques ou des substrats de silicium photoconducteur. ⁵ Cependant, tous ces systèmes ont des côtés lumineux et des inconvénients. En particulier, l'absorption endogène de cellules dans le domaine visible est faible et non fiable, et la génération concomitante d'espèces réactives de l'oxygène peut être nuisible à la cellule. En général, les IR est utilisé pour induire chauffage thermique local du fait de l'absorption d'eau, mais le coefficient d'extinction de l'eau est faible, ce qui nécessite stlumière infrarouge rong (de quelques dizaines à des centaines de W / mm ²⁾ qui est difficile à livrer via optique du microscope standard et peut poser des problèmes de sécurité pour les applications in vivo. D'autre part, les composés de cages photo-commutables ont une action limitée dans le temps et nécessitent souvent la lumière UV qui est difficile à remettre en raison de la pénétration tissulaire limitée. De plus, ils souffrent de problèmes de diffusion des composés activés lors de la photolyse en dehors de la zone éclairée. Enfin, des outils optogénétiques ont permis aux scientifiques de cibler sous-population cellulaire spécifique et des sous-compartiments et sont rapidement en train de devenir l'une des technologies clés dans la recherche neuroscientifique. Cependant, l'insertion d'un segment d'ADN exogène via un vecteur viral soulève des questions importantes sur la sécurité, notamment en vue de l'adoption sur des patients humains. ^5,6 Pour ces raisons, la recherche sur de nouveaux matériaux et dispositifs capables de manipulation optique de la cellule est un sujet extrêmement chaud.

Récemment, un romanapproche basée sur l'utilisation de polymères conjugués sensibles à la lumière, capable de transduire efficacement un stimulus optique en une modulation de l'activité électrique de la cellule, a été proposée. La cellule de stimulation par Polymer photoexcitation (CSPP) technique exploite de nombreuses fonctionnalités clés génériques, typique de semi-conducteurs organiques: ils sont intrinsèquement sensibles à la lumière dans le domaine visible; ⁷ ils sont biocompatible, souple et adaptable et leur flexibilité mécanique permet une interface intime avec le tissu à la fois in vitro et in vivo ^10.8. En dehors de cela, ils peuvent être facilement fonctionnalisés de mieux adapter à l'interface avec les cellules vivantes, et de permettre à excitation spécifique, sonder et de détection des capacités. ^11,12 De plus, ils support électronique ainsi que le transport ionique, ce qui les rend idéal pour la combinaison de l'électronique annonce la biologie. ^13,14 intéressant, ils peuvent fonctionner en mode photovoltaïque, évitant la nécessité d'appliquer un biais f extérieurou la stimulation de la cellule optique efficace. ¹⁵

La fiabilité de la technique CSPP a déjà été démontré dans plusieurs systèmes, y compris les neurones primaires, ^{15,16 astrocytes,} 17 lignées cellulaires secondaires ^{18 et} tissus rétiniens explantées. ¹⁶ Dans ce travail, toutes les mesures nécessaires pour fabriquer un bio-polymère sensible à la lumière ^interface 19 pour la stimulation optique de systèmes in vitro sont décrits en détail. Comme une étude de cas, un système photovoltaïque mélange organique prototypique de la région régulière poly (3-hexylthiophène) (rr-P3HT), fonctionnant comme le donneur d'électrons, et d'ester phényl-C61-butyrique-acide-méthyle (PCBM), agissant en tant que accepteur d'électrons est utilisé. Comme le système biologique, des cellules de rein embryonnaire humain (HEK-293) sont utilisées. Un exemple d'un protocole de photostimulation avec l'enregistrement relatif de l'activité des cellules par l'intermédiaire de mesures électrophysiologiques est fourni.

La plate-forme décritest cependant de validité générale, et il peut facilement être étendue à l'utilisation d'autres polymères conjugués (en ajustant convenablement le procédé en solution de préparation et les paramètres de dépôt), différents types de cellules (par correctement changeant le protocole de culture de cellules, la procédure et le temps requis placage pour l'ensemencement et la prolifération cellulaire) et des protocoles de stimulation différentes (longueur d'onde de la lumière, la fréquence et la durée des stimuli, densité de photoexcitation).

Protocol

1. Préparation des substrats photoactifs Préparer une P3HT: PCBM solution (1: 1 en poids / poids) dans du chlorobenzène à une concentration de P3HT de 20 g / L. Mélanger la solution avec un agitateur magnétique pendant au moins 4 heures à 60 ° C. Considérons un volume de 150 ul de solution de substrat à chaque être préparé. Lames propres de ITO verre (= 10 Ω / m² de R, 18×18 mm 2, 170 um d'épaisseur) avec bains consécutifs d'eau déminéralisée, l'…

Representative Results

Les cellules peuvent être facilement cultivées sur P3HT: PCBM substrats, à condition qu 'une couche d'adhérence est déposée convenable (tel que la fibronectine utilisé dans l'étape 3.2 du protocole décrit). P3HT: PCBM pics d'absorption optique dans la partie verte du spectre visible; cependant, d'autres polymères conjugués sensibles à la lumière peuvent être sélectionnés, en fonction de la gamme de longueurs d'onde de photostimulation préféré <s…

Discussion

Les étapes critiques du protocole rapporté pour in vitro stimulation optique de cellules concernent principalement le choix du polymère sensible à la lumière, les paramètres de stérilisation thermique, l'intensité et la durée des stimuli lumineux. Un P3HT: PCBM film mince a été choisi ici, car il garantit une bonne stabilité temporelle et électrochimique. Cependant, il faut noter que tous les polymères sensibles à la lumière peuvent offrir des performances analogiques, ²² plus pr?…

Materials

rr-P3HT	Sigma Aldrich	698989-5G
ITO-coated substrates	Nano-CS	IT10300100
Fibronectin	Sigma Aldrich	F1141
chlorobenzene	Sigma Aldrich	319996
PCBM	Nano-C	Nano-CPCBM-BF
acetone	Sigma Aldrich	270725
isopropyl alcohol	Sigma Aldrich	563935
HEK cells	LGC standards srl	ATCC-CRL-1573
HEPES	Sigma Aldrich	H0887
PBS	Sigma Aldrich	P5244
E-MEM	LGC standards srl	ATCC-30-2003
EDTA	Sigma Aldrich	E8008-
FBS	LGC standards srl	ATCC-30-2020