संयुग्मित पॉलिमर द्वारा कोशिकाओं विद्युत गतिविधि के रहने की ऑप्टिकल नियंत्रण

Summary

A method for stimulation of in-vitro cell cultures electrical activity with visible light, based on the use of organic semiconducting polymers is described.

Abstract

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated polymers display several optimal properties as substrates for biological systems, such as good biocompatibility, excellent mechanical properties, cheap and easy processing technology, and possibility of deposition on light, thin and flexible substrates. These materials have been employed for cellular interfaces like neural probes, transistors for excitation and recording of neural activity, biosensors and actuators for drug release. Recent experiments have also demonstrated the possibility to use conjugated polymers for all-optical modulation of the electrical activity of cells. Several in-vitro study cases have been reported, including primary neuronal networks, astrocytes and secondary line cells. Moreover, signal photo-transduction mediated by organic polymers has been shown to restore light sensitivity in degenerated retinas, suggesting that these devices may be used for artificial retinal prosthesis in the future. All in all, light sensitive conjugated polymers represent a new approach for optical modulation of cellular activity.

In this work, all the steps required to fabricate a bio-polymer interface for optical excitation of living cells are described. The function of the active interface is to transduce the light stimulus into a modulation of the cell membrane potential. As a study case, useful for in-vitro studies, a polythiophene thin film is used as the functional, light absorbing layer, and Human Embryonic Kidney (HEK-293) cells are employed as the biological component of the interface. Practical examples of successful control of the cell membrane potential upon stimulation with light pulses of different duration are provided. In particular, it is shown that both depolarizing and hyperpolarizing effects on the cell membrane can be achieved depending on the duration of the light stimulus. The reported protocol is of general validity and can be straightforwardly extended to other biological preparations.

Introduction

एक सटीक स्थानिक और लौकिक संकल्प के साथ सेलुलर गतिविधि में हेरफेर करने की संभावना neuroscientific अनुसंधान के क्षेत्र में और तंत्रिका विज्ञान और मानसिक विकारों के उपचार में एक महत्वपूर्ण रणनीति का प्रतिनिधित्व करता है। ^एक पारंपरिक तरीकों निकटता में या के साथ संपर्क में तैनात इलेक्ट्रोड का उपयोग कोशिकाओं की बिजली की उत्तेजना के आधार पर कर रहे हैं (इन विवो मस्तिष्क के ऊतकों, एकल कोशिका, सेलुलर नेटवर्क, मस्तिष्क के स्लाइस) अलग जटिलता का हो सकता है, जो लक्षित प्रणाली, ^2। पिछली सदी के दौरान, पैच दबाना, धातु और सब्सट्रेट एकीकृत इलेक्ट्रोड का उपयोग शरीर विज्ञान और एकल न्यूरॉन्स की और तंत्रिका नेटवर्क के कामकाज तंत्र के pathophysiology की एक विस्तृत चित्र प्रदान की है। हालांकि, बिजली की उत्तेजना महत्वपूर्ण सीमाओं से ग्रस्त है। पहले एक कारण आसानी से अनुकूलित नहीं किया जा सकता है, जो इलेक्ट्रोड और अपने निर्धारित ज्यामिति के भौतिक आयाम, एक आम तौर पर गरीब स्थानिक संकल्प से संबंधित हैजैविक ऊतकों की तरह जटिल संगठित प्रणाली के लिए। इसके अलावा, इलेक्ट्रोड प्रतिबाधा के लिए और उत्तेजना और रिकॉर्डिंग सिस्टम के बीच परस्पर बात की समस्याओं से संबंधित माप के अंतिम संकेत करने वाली शोर अनुपात खराब हो सकता है। ³ दूसरी ओर, उत्तेजना के लिए प्रकाश के उपयोग के कई सीमाओं को पार करने के लिए मदद मिल सकती है बिजली के दृष्टिकोण की। सबसे पहले, यह संभव विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं या यहां तक ​​कि उप-सेल के डिब्बों को लक्षित करने के लिए कर रही है, अभूतपूर्व स्थानिक (<1 माइक्रोन) और अस्थायी समाधान (<1 मिसे) प्रदान करता है। यह ब्याज के ऊतकों के साथ किसी भी शारीरिक संपर्क से बचा जाता है और रिकॉर्डिंग से उत्तेजना disentangles के बाद से इसके अलावा यह अत्यधिक गैर इनवेसिव है। इसके अलावा, प्रकाश की तीव्रता और तरंग दैर्ध्य दोनों ठीक विनियमित किया जा सकता है और इस तरह विविध उत्तेजना प्रोटोकॉल लागू किया जा सकता है। ^3,4

हालांकि, पशु कोशिकाओं के विशाल बहुमत के प्रकाश के लिए किसी भी विशिष्ट संवेदनशीलता मौजूद नहीं है। ऑप्टिकल stimulatio के लिए कई रणनीतियोंएन इस प्रकार, या तो पास या कोशिकाओं के भीतर प्रकाश के प्रति संवेदनशील आणविक मध्यस्थों का शोषण, या सेल के करीब बाहर रखा प्रकाश सक्रिय डिवाइस का उपयोग करते हुए प्रस्ताव किया गया है। पूर्व श्रेणी दृश्य या अवरक्त (आईआर) प्रकाश के माध्यम से उत्तेजना, साथ ही photocleavable / photoisomerizable यौगिकों या सहज आणविक प्रवर्तक (optogenetics) की आनुवंशिक अभिव्यक्ति या तो के उपयोग की तरह अंतर्जात तंत्र को दर्शाता है। उत्तरार्द्ध वर्ग अकार्बनिक नैनो / सूक्ष्म कणों या photoconductive सिलिकॉन substrates के उपयोग से प्राप्त बहिर्जात उत्तेजना के लिए तकनीक भी शामिल है। ⁵ फिर भी, इन सभी प्रणालियों उज्ज्वल पक्ष और कमियां हैं। विशेष रूप से, दिखाई रेंज में कोशिकाओं की अंतर्जात अवशोषण कमजोर और विश्वसनीय नहीं है, और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के सहवर्ती पीढ़ी सेल के लिए हानिकारक हो सकता है। सामान्य तौर पर, आईआर की वजह से पानी के अवशोषण के लिए स्थानीय थर्मल हीटिंग उत्प्रेरण के लिए प्रयोग किया जाता है, लेकिन पानी के विलुप्त होने के गुणांक इस प्रकार सेंट की आवश्यकता होती है, छोटा हैमानक माइक्रोस्कोप प्रकाशिकी के माध्यम से वितरित करने के लिए और इन विवो अनुप्रयोगों के लिए सुरक्षा चिंताओं खड़ी हो सकती है मुश्किल है कि (दसियों से W / ² मिमी के सैकड़ों करने के लिए) रोंग अवरक्त प्रकाश। दूसरी ओर, फोटो switchable caging यौगिकों एक समय सीमित कार्रवाई की है और अक्सर कारण सीमित ऊतक प्रवेश करने के लिए वितरित करने के लिए कठिन है कि पराबैंगनी प्रकाश की आवश्यकता होती है। इसके अलावा वे प्रबुद्ध क्षेत्र के बाहर photolysis पर सक्रिय यौगिकों के प्रसार की समस्याओं से ग्रस्त हैं। अंत में, optogenetic उपकरण विशिष्ट सेलुलर उप-जनसंख्या और उप डिब्बों को लक्षित करने के लिए वैज्ञानिकों की अनुमति दी है और तेजी से neuroscientific अनुसंधान के क्षेत्र में महत्वपूर्ण प्रौद्योगिकियों में से एक के रूप में उभर रहे हैं। हालांकि, एक वायरल वेक्टर के माध्यम से एक exogenous डीएनए खंड डालने विशेष रूप से मानव रोगियों पर गोद लेने के विचार में, महत्वपूर्ण सुरक्षा मुद्दों को उठाती है। इन कारणों के लिए ^5,6, सेल ऑप्टिकल हेरफेर करने में सक्षम नई सामग्री और उपकरणों पर अनुसंधान के एक अत्यंत गर्म विषय है।

हाल ही में, एक उपन्यासकुशलतापूर्वक सेल बिजली की गतिविधि का एक मॉडुलन में एक ऑप्टिकल प्रोत्साहन transduce करने में सक्षम प्रकाश के प्रति संवेदनशील संयुग्मित पॉलिमर, के उपयोग पर आधारित दृष्टिकोण, प्रस्ताव किया गया है। ⁷ वे biocompatible मुलायम और पक्षधर रहे हैं और उनके यांत्रिक लचीलापन ऊतक के साथ एक अंतरंग इंटरफेस की अनुमति देता है, और वे दिखाई रेंज में रोशनी करने के लिए आंतरिक रूप से संवेदनशील हैं: पॉलिमर photoexcitation द्वारा सेल उत्तेजना (CSPP) तकनीक ठेठ जैविक अर्धचालकों के कई महत्वपूर्ण: सक्षम सुविधाओं का लाभ उठाते इन विट्रो में और इन विवो ^8-10 दोनों। इसके अलावा, वे आसानी से बेहतर जांच और क्षमताओं संवेदन, विशिष्ट उत्तेजना सक्षम करने के लिए जीवित कोशिकाओं के साथ इंटरफेस के लिए अनुकूल है, और करने के लिए क्रियाशील किया जा सकता है। ^11,12 इसके अलावा, वे संयोजन के लिए आदर्श बना, आयनिक परिवहन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से इलेक्ट्रॉनिक का समर्थन इलेक्ट्रॉनिक्स विज्ञापन जीव विज्ञान की। दिलचस्प बात यह ^13,14, वे एक बाहरी पूर्वाग्रह च लागू करने के लिए जरूरत से बचने, फोटोवोल्टिक मोड में काम कर सकते हैंया कुशल सेल ऑप्टिकल उत्तेजना। ¹⁵

CSPP तकनीक की विश्वसनीयता पहले से प्राथमिक न्यूरॉन्स, ^15,16 astrocytes, ¹⁷ माध्यमिक सेल लाइनों ¹⁸ और explanted रेटिना के ऊतकों सहित कई प्रणालियों में प्रदर्शन किया गया है। इस काम में ^16, सभी आवश्यक कदम एक प्रकाश के प्रति संवेदनशील जैव बहुलक निर्माण करने के लिए इन-विट्रो प्रणालियों के ऑप्टिकल उत्तेजना के लिए इंटरफेस ¹⁹ में विस्तार से बताया गया है। के रूप में अभिनय एक इलेक्ट्रॉन दाता के रूप में कार्य अध्ययन के मामले में, क्षेत्र-नियमित पाली (3-hexylthiophene) के एक प्रोटोटाइप जैविक फोटोवोल्टिक मिश्रण (RR-P3HT), और फिनाइल-C61-ब्यूटीरिक एसिड मिथाइल एस्टर (PCBM), के रूप में इलेक्ट्रॉन स्वीकर्ता कार्यरत है। जैविक प्रणाली के रूप में, मानव भ्रूण गुर्दे (HEK-293) कोशिकाओं का इस्तेमाल कर रहे हैं। Electrophysiological माप के माध्यम से सेल गतिविधि के रिश्तेदार रिकॉर्डिंग के साथ एक photostimulation प्रोटोकॉल का एक उदाहरण प्रदान की जाती है।

वर्णित मंचहालांकि सामान्य वैधता की है, और यह आसानी से ठीक से, सेल संस्कृति प्रोटोकॉल को बदलने का अनुरोध प्रक्रिया और समय चढ़ाना द्वारा, विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं ((ठीक से समाधान तैयार करने की प्रक्रिया और बयान मापदंडों का समायोजन करके) अन्य संयुग्मित पॉलिमर का उपयोग करने के लिए बढ़ाया जा सकता है सेल बोने और प्रसार) और विभिन्न उत्तेजना प्रोटोकॉल (प्रकाश की तरंग दैर्ध्य, उत्तेजनाओं आवृत्ति और अवधि, photoexcitation घनत्व) के लिए।

Protocol

प्रकाश द्वारा सहज प्रभावित Substrates के 1. तैयारी एक P3HT तैयार: PCBM समाधान: chlorobenzene में (1 डब्ल्यू डब्ल्यू / 1) 20 जी / एल के एक P3HT एकाग्रता में। 60 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 4 घंटे के लिए एक चुंबकीय उत्तेजक के साथ समाधान ?…

Representative Results

प्रकोष्ठों P3HT पर आसानी से संवर्धित किया जा सकता है: PCBM substrates, (वर्णित प्रोटोकॉल का 3.2 चरण में इस्तेमाल किया फ़ाइब्रोनेक्टिन) की तरह एक उपयुक्त आसंजन परत जमा है कि प्रदान की है। P3HT: दृश्य स्पेक्ट्?…

Discussion

कोशिकाओं के ऑप्टिकल उत्तेजना मुख्य रूप से प्रकाश के प्रति संवेदनशील बहुलक की पसंद, थर्मल नसबंदी मापदंडों, तीव्रता और प्रकाश उत्तेजनाओं की अवधि को चिंता में इन विट्रो के लिए सूचना प्रोटोकॉल का महत?…

Materials

rr-P3HT	Sigma Aldrich	698989-5G
ITO-coated substrates	Nano-CS	IT10300100
Fibronectin	Sigma Aldrich	F1141
chlorobenzene	Sigma Aldrich	319996
PCBM	Nano-C	Nano-CPCBM-BF
acetone	Sigma Aldrich	270725
isopropyl alcohol	Sigma Aldrich	563935
HEK cells	LGC standards srl	ATCC-CRL-1573
HEPES	Sigma Aldrich	H0887
PBS	Sigma Aldrich	P5244
E-MEM	LGC standards srl	ATCC-30-2003
EDTA	Sigma Aldrich	E8008-
FBS	LGC standards srl	ATCC-30-2020