Optisk Kontroll av levende celler elektrisk aktivitet ved Conjugated Polymers

Summary

A method for stimulation of in-vitro cell cultures electrical activity with visible light, based on the use of organic semiconducting polymers is described.

Abstract

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated polymers display several optimal properties as substrates for biological systems, such as good biocompatibility, excellent mechanical properties, cheap and easy processing technology, and possibility of deposition on light, thin and flexible substrates. These materials have been employed for cellular interfaces like neural probes, transistors for excitation and recording of neural activity, biosensors and actuators for drug release. Recent experiments have also demonstrated the possibility to use conjugated polymers for all-optical modulation of the electrical activity of cells. Several in-vitro study cases have been reported, including primary neuronal networks, astrocytes and secondary line cells. Moreover, signal photo-transduction mediated by organic polymers has been shown to restore light sensitivity in degenerated retinas, suggesting that these devices may be used for artificial retinal prosthesis in the future. All in all, light sensitive conjugated polymers represent a new approach for optical modulation of cellular activity.

In this work, all the steps required to fabricate a bio-polymer interface for optical excitation of living cells are described. The function of the active interface is to transduce the light stimulus into a modulation of the cell membrane potential. As a study case, useful for in-vitro studies, a polythiophene thin film is used as the functional, light absorbing layer, and Human Embryonic Kidney (HEK-293) cells are employed as the biological component of the interface. Practical examples of successful control of the cell membrane potential upon stimulation with light pulses of different duration are provided. In particular, it is shown that both depolarizing and hyperpolarizing effects on the cell membrane can be achieved depending on the duration of the light stimulus. The reported protocol is of general validity and can be straightforwardly extended to other biological preparations.

Introduction

Muligheten for å manipulere den cellulære aktivitet med en nøyaktig romlig og tidsmessig oppløsning er en viktig strategi i nevro undersøkelser og ved behandling av nevrologiske og psykiatriske forstyrrelser. ¹ Tradisjonelle metoder er basert på elektrisk stimulering av celler ved hjelp av elektroder som er plassert i umiddelbar nærhet av eller i kontakt med målrettet system, ^{2 som} kan være av forskjellig kompleksitet (enkeltcelle, mobilnettverk, hjerneskiver, in-vivo hjernevev). I løpet av det siste århundret, har bruk av patch-clamp, metall og substrat-integrerte elektroder gitt et detaljert bilde av fysiologi og patofysiologi av enkeltnerveceller og av de fungerende mekanismer for nevrale nettverk. Imidlertid lider elektrisk stimulering av viktige begrensninger. Den første som er knyttet til et generelt dårlig romlig oppløsning på grunn av de fysiske dimensjoner av elektrodene og deres faste geometri, som ikke lett kan tilpassestil komplekse organiserte systemer som biologiske vev. Også problemer knyttet til elektrodene impedans og av krysstale mellom stimulering og registreringssystemer kan forringes det endelige signal-til-støy-forholdet av målingene. ^{3 På} den annen side kan bruk av lys for stimulering bidra til å overvinne mange begrensninger av det elektriske opplegget. Først av alt, det gir enestående romlig (<1 mm) og tidsmessig oppløsning (<1 msek), noe som gjør det mulig å målrette spesifikke celletyper eller til og med sub-cellekamre. I tillegg er det sterkt ikke-invasiv ettersom den unngår noen fysisk kontakt med vevet av interesse og disentangles stimulering av opptak. Videre kan både lys intensitet og bølgelengde reguleres nøyaktig, og således forskjellige stimuleringsregimer kan brukes. ^3,4

Men, det store flertallet av dyreceller ikke presentere noen spesiell følsomhet for lys. Flere strategier for optisk stimulation har derfor vært foreslått, enten utnytte lysfølsomme molekylære mediatorene i nærheten eller i cellene, eller ved hjelp av fotoaktive enhet plassert eksternt, i nærheten av cellen. Førstnevnte kategori viser til endogene mekanismer som stimulering via synlig eller infrarødt (IR) lys, så vel som anvendelse av enten photoisomerizable / photocleavable forbindelser eller genetisk ekspresjon av foto molekylære aktuatorer (optogenetics). Den sistnevnte klasse omfatter teknikker for eksogen stimulering oppnås med bruk av uorganiske nano / mikropartikler eller fotoledende silisium substrater. ⁵ Ikke desto mindre er alle disse systemer har klare sider og ulemper. Spesielt er endogen absorpsjon av celler i det synlige området svake og ikke pålitelig, og samtidig generering av reaktive oksygenarter kan være skadelige for cellen. Generelt er IR brukes til å indusere lokal termisk oppvarming på grunn av vannopptak, men ekstinksjonskoeffisient av vann er liten, og dermed krever strong infrarødt lys (fra titalls til hundrevis av W / mm ²⁾ som er vanskelig å levere via standard mikroskop optikk og kan utgjøre sikkerhet bekymringer for i-vivo applikasjoner. På den annen side, foto vendbar sperre forbindelser har en tidsbegrenset virkning og krever ofte UV-lys som er vanskelig å levere på grunn av begrenset vevspenetrering. Dessuten lider de av diffusjon problemene med de aktiverte forbindelsene ved fotolyse utenfor det belyste området. Endelig har optogenetic verktøy tillatt forskere å målrette bestemt cellulær undergruppe og underrommene og er raskt voksende som en av de viktigste teknologiene i nevrovitenskapelig forskning. Men å sette inn et eksogent DNA segment via en viral vektor reiser viktige sikkerhetsspørsmål, spesielt med tanke på adopsjon på menneskelige pasienter. ^5,6 Av disse grunner, er forskning på nye materialer og utstyr som kan cellen optisk manipulasjon en ekstremt hett tema.

Nylig har en nytilnærming basert på bruk av lysfølsomme konjugerte polymerer, i stand til effektivt å omsette en optisk stimulus til en modulering av celle elektrisk aktivitet, har vært foreslått. The Cell Stimulering av Polymer foto-(CSPP) teknikk utnytter mange viktige aktiverer har typisk av organiske halvledere: de er egentlig følsom for lys i det synlige området, ⁷ de er biokompatible, myk og formbar, og deres mekaniske fleksibilitet tillater en intim grensesnitt med vev både in-vitro og in-vivo ^8-10. Bortsett fra det, kan de lett funksjon å bedre tilpasse seg grensesnittet med levende celler, og for å aktivere bestemte eksitasjon, sondering og sensing evner. ^11,12 Videre støtter de elektroniske samt ionisk transport, noe som gjør dem ideelle for kombinasjonen av elektronikk annonsen biologi. ^13,14 Interessant, kan de jobbe i photovoltaic modus, unngå behovet for å bruke en ekstern skjevhet feller effektiv celle optiske stimulering. ¹⁵

Påliteligheten av CSPP teknikken har tidligere blitt vist i flere systemer, inkludert primær nevroner, ^15,16 astrocytter, ¹⁷ sekundære cellelinjer ^{18 og} eksplanterte retinal vev. ¹⁶ I dette arbeidet, alle de nødvendige skritt for å dikte opp en lysfølsom bio-polymer grensesnitt ^{19 for} optisk stimulering av in-vitro-system er beskrevet i detalj. Som en studie tilfelle, en prototypisk organisk fotoelektrisk blanding av region-faste poly (3-hexylthiophene) (rr-P3HT), som fungerer som elektrondonor, og fenyl-C61-smør-syre-metylester (PCBM), som virker som den elektron akseptor anvendes. Som det biologiske system, er humane embryonale nyre (HEK-293) celler anvendt. Et eksempel på en protokoll photostimulation med den relative opptak av celleaktivitet via elektrofysiologiske målinger er gitt.

Den beskrevne plattformer imidlertid av generell gyldighet, og det kan lett utvides til anvendelsen av andre konjugerte polymerer (ved riktig justering av løsningen fremstillingsprosessen og avsetningsparametrene), forskjellige celletyper (ved passende å endre celledyrkingsprotokollen, plating prosedyre og tid ønskede for celle seeding og spredning) og ulike stimulerings protokoller (lys bølgelengde, stimuli hyppighet og varighet, foto-tetthet).

Protocol

1. Utarbeidelse av fotoaktive Underlag Tilbered en P3HT: PCBM-løsning (1: 1 w / w) i klorbenzen ved en P3HT konsentrasjon på 20 g / l. Blande oppløsningen med en magnetisk rører i minst 4 timer ved 60 ° C. Betrakt et volum på 150 ul oppløsning for hvert substrat som skal fremstilles. Rene ITO-belagte glassplater (R s = 10 Ω / kvadrat, 18×18 mm 2, tykkelse 170 pm) med påfølgende bad av avionisert vann, aceton og isopropanol i en sonikator (10 min for hvert trinn). Tør…

Representative Results

Celler kan lett dyrkes på P3HT: PCBM underlag, forutsatt at et passende klebesjikt er avsatt (som fibronektin benyttet i trinn 3.2 i den beskrevne protokoll). P3HT: PCBM optisk absorpsjonstopper i den grønne delen av det synlige spekteret; men andre lysfølsomme konjugerte polymerer kan velges i henhold til den foretrukne photostimulation bølgelengder område (figur 2). Biokompatibilitet av disse substrater er blitt demonstrert ikke bare med cellelinjer 18,21</su…

Discussion

Kritiske trinn av den rapporterte protokoll for di vitro-optiske stimulering av celler i hovedsak dreier seg om valget av lys-følsom polymer, det termiske steriliserings parametere, intensiteten og varigheten av lys stimuli. En P3HT: PCBM tynn film ble valgt her, siden det garanterer god tidsmessig og elektrokjemisk stabilitet. Imidlertid bør man legge merke til at ikke alle lysfølsomme polymerer kan tilby analoge forestillinger, ²² mer spesifikt ved belysning. I tillegg, i dette tilfelle…

Materials

rr-P3HT	Sigma Aldrich	698989-5G
ITO-coated substrates	Nano-CS	IT10300100
Fibronectin	Sigma Aldrich	F1141
chlorobenzene	Sigma Aldrich	319996
PCBM	Nano-C	Nano-CPCBM-BF
acetone	Sigma Aldrich	270725
isopropyl alcohol	Sigma Aldrich	563935
HEK cells	LGC standards srl	ATCC-CRL-1573
HEPES	Sigma Aldrich	H0887
PBS	Sigma Aldrich	P5244
E-MEM	LGC standards srl	ATCC-30-2003
EDTA	Sigma Aldrich	E8008-
FBS	LGC standards srl	ATCC-30-2020