Controle óptico de células vivas atividade elétrica por conjugados Polymers

Summary

A method for stimulation of in-vitro cell cultures electrical activity with visible light, based on the use of organic semiconducting polymers is described.

Abstract

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated polymers display several optimal properties as substrates for biological systems, such as good biocompatibility, excellent mechanical properties, cheap and easy processing technology, and possibility of deposition on light, thin and flexible substrates. These materials have been employed for cellular interfaces like neural probes, transistors for excitation and recording of neural activity, biosensors and actuators for drug release. Recent experiments have also demonstrated the possibility to use conjugated polymers for all-optical modulation of the electrical activity of cells. Several in-vitro study cases have been reported, including primary neuronal networks, astrocytes and secondary line cells. Moreover, signal photo-transduction mediated by organic polymers has been shown to restore light sensitivity in degenerated retinas, suggesting that these devices may be used for artificial retinal prosthesis in the future. All in all, light sensitive conjugated polymers represent a new approach for optical modulation of cellular activity.

In this work, all the steps required to fabricate a bio-polymer interface for optical excitation of living cells are described. The function of the active interface is to transduce the light stimulus into a modulation of the cell membrane potential. As a study case, useful for in-vitro studies, a polythiophene thin film is used as the functional, light absorbing layer, and Human Embryonic Kidney (HEK-293) cells are employed as the biological component of the interface. Practical examples of successful control of the cell membrane potential upon stimulation with light pulses of different duration are provided. In particular, it is shown that both depolarizing and hyperpolarizing effects on the cell membrane can be achieved depending on the duration of the light stimulus. The reported protocol is of general validity and can be straightforwardly extended to other biological preparations.

Introduction

A possibilidade de manipular a actividade celular com uma resolução espacial e temporal precisa representa uma estratégia importante na investigação neuroscientific e no tratamento de distúrbios neurológicos e psiquiátricos. ¹ Os métodos tradicionais são baseados na estimulação eléctrica de células usando eléctrodos posicionado na proximidade ou em contacto com o sistema-alvo, ² que pode ser de complexidade diferente (célula única rede celular, fatias de cérebro, in vivo tecidos cerebrais). Durante o século passado, o uso de patch-clamp, metal e eletrodos integrados de substrato proporcionaram um quadro detalhado da fisiologia e fisiopatologia de neurônios individuais e dos mecanismos de funcionamento das redes neurais. No entanto, a estimulação elétrica sofre de limitações importantes. O primeiro está relacionado com uma resolução espacial geralmente pobres devido às dimensões físicas dos eléctrodos e sua geometria fixa, que não pode ser facilmente adaptadopara sistemas complexos organizados como tecidos biológicos. Além disso, os problemas relacionados com a impedância de eléctrodos e de conversas cruzadas entre os sistemas de estimulação e de registo pode deteriorar-se a proporção final de sinal-para-ruído das medições. ³ Por outro lado, o uso de luz para a estimulação pode ajudar a superar muitas limitações da abordagem eléctrica. Primeiro de tudo, oferece espacial sem precedentes (<1 mm) e a resolução temporal (<1 ms), tornando-se possível para atingir tipos celulares específicos ou mesmo compartimentos sub-celulares. Além disso, é altamente não-invasivo, uma vez que evita qualquer contacto físico com o tecido de interesse e disentangles estimulação de gravação. Além disso, tanto a intensidade da luz de comprimento de onda e pode ser regulada com precisão e, consequentemente, diferentes protocolos de estimulação pode ser aplicada. ^3,4

No entanto, a grande maioria das células de animais não apresentam sensibilidade específica à luz. Várias estratégias para stimulatio ópticoN foram assim propostas, quer explorando mediadores moleculares sensível à luz próxima ou no interior das células, ou utilizando um dispositivo fotoactivo colocado externamente, perto da célula. A primeira categoria refere-se a mecanismos endógenos como a estimulação através de (IR) de luz infravermelha ou visível, bem como a utilização quer de compostos photoisomerizable / fotoclivável ou a expressão genética de actuadores moleculares fotossensíveis (Optogenetics). Esta última classe inclui técnicas de estimulação exógena alcançado com o uso de nano / micro-partículas inorgânicas ou substratos de silício fotocondutoras. ⁵ No entanto, todos estes sistemas têm lados e inconvenientes brilhantes. Em particular, a absorção de células endógenas na gama do visível é fraco e não é fiável, e a geração concomitante de espécies de oxigénio reactivas pode ser prejudicial para a célula. Em geral, RI é usado para a indução de aquecimento térmico local, devido à absorção de água, mas o coeficiente de extinção de água é pequena, necessitando assim de rRong luz infravermelha (a partir de dezenas a centenas de W / ^mm2), que é difícil de entregar através de microscopia óptica padrão e podem representar as preocupações de segurança para aplicações in vivo. Por outro lado, os compostos de enjaulamento foto-comutável têm uma ação limitada de tempo e muitas vezes necessitam de luz UV que é difícil de entregar devido à penetração nos tecidos limitado. Além disso, eles sofrem de problemas de difusão dos compostos activada após fotólise fora da área iluminada. Finalmente, ferramentas optogenética permitiram aos cientistas direcionar subpopulação celular específica e sub-compartimentos e estão a emergir rapidamente como uma das tecnologias-chave na pesquisa neurocientífica. No entanto, a inserção de um segmento de DNA exógeno através de um vetor viral levanta questões importantes de segurança, especialmente em vista da adopção, em pacientes humanos. ^5,6 Por estas razões, a investigação sobre novos materiais e dispositivos capazes de manipulação óptica celular é um tema extremamente quente.

Recentemente, um romanceabordagem com base na utilização de polímeros conjugados sensíveis à luz, capaz de transduzir eficientemente um estímulo óptico numa modulação da actividade eléctrica da célula, tem sido proposto. A estimulação das células por Polymer fotoexcitação (CSPP) técnica explora muitas características-chave de habilitação típico de semicondutores orgânicos: são intrinsecamente sensível à luz na faixa visível; ⁷ eles são biocompatíveis, macio e moldável e sua flexibilidade mecânica permite uma interface íntimo com o tecido tanto in vitro e in vivo ^8-10. Além disso, eles podem ser facilmente funcionalizados para uma melhor adaptação à interface com células vivas, e para permitir a excitação específica, sentindo capacidades sondagem e ^11,12. Além disso, eles oferecem suporte electrónico, bem como transporte iônico, tornando-os ideais para a combinação da biologia anúncio eletrônica ^13,14 Curiosamente., eles podem trabalhar no modo fotovoltaico, evitando a necessidade de aplicar um viés externo f¹⁵ ou a estimulação da célula óptica eficiente.

A fiabilidade da técnica CSPP foi anteriormente demonstrada em vários sistemas, incluindo neurónios primárias, ^15,16 astrócitos, ¹⁷ linhas de células secundárias ¹⁸ e tecidos da retina explantados. ¹⁶ Neste trabalho, todos os passos necessários para o fabrico de um bio-polímero sensível à luz de interface ¹⁹ para a estimulação óptico de sistemas in vitro são descritos em detalhe. Como estudo de caso, uma mistura fotovoltaica orgânica prototípico da região regular poli (3-hexiltiofeno) (rr-P3HT), funcionando como o doador de elétrons, e éster de fenil-C61-butírico-ácido-metil (PCBM), atuando como o receptor de elétrons é empregado. À medida que o sistema biológico, rim embrionário humano (HEK-293), as células são usadas. Um exemplo de um protocolo fotoestimulação com a gravação relativa da actividade das células através de medições electrofisiológicas é fornecido.

A plataforma descritoNo entanto, é de aplicabilidade geral, e pode ser facilmente adaptado para o uso de outros polímeros conjugados (ajustando adequadamente o processo de solução de preparação e os parâmetros de deposição), diferentes tipos de células (por mudar apropriadamente o protocolo de cultura de células, chapeamento procedimento e tempo requerido para semeadura e proliferação celular) e diferentes protocolos de estimulação (comprimento de onda de luz, estímulos de frequência e duração, densidade fotoexcitação).

Protocol

1. Preparação de Substratos fotoactivos Prepara-se uma P3HT: PCBM solução (1: 1 w / w) em clorobenzeno a uma concentração P3HT a 20 g / L. Misture a solução com um agitador magnético durante pelo menos 4 h a 60 ° C. Considere-se um volume de 150 ul de solução para cada substrato a ser preparado. Limpas lâminas de vidro revestido de ITO (R-S = 10 Ω / sq, 18×18 mm 2, espessura 170 um) com lavagens sucessivas de água desionizada, acetona e isopropanol num sonicador …

Representative Results

As células podem ser facilmente cultivadas em P3HT: substratos PCBM, desde que uma camada de adesão é depositado adequado (como a fibronectina usado no passo 3.2 do protocolo descrito). P3HT: PCBM picos de absorção óptica na parte verde do espectro visível; No entanto, outros polímeros conjugados sensíveis à luz pode ser seleccionada, de acordo com a faixa de comprimentos de onda preferida fotoestimulação (Figura 2). A biocompatibilidade destes substratos foi…

Discussion

As etapas críticas do protocolo relatado para in-vitro estimulação óptica de células essencialmente com a escolha do polímero sensível à luz, os parâmetros de esterilização térmica, a intensidade ea duração dos estímulos luminosos. A P3HT: película fina PCBM foi selecionada aqui, uma vez que garante uma boa estabilidade temporal e eletroquímica. No entanto, deve-se notar que nem todos os polímeros sensíveis à luz pode oferecer performances analógicos, ^22, mais especificamente, so…

Materials

rr-P3HT	Sigma Aldrich	698989-5G
ITO-coated substrates	Nano-CS	IT10300100
Fibronectin	Sigma Aldrich	F1141
chlorobenzene	Sigma Aldrich	319996
PCBM	Nano-C	Nano-CPCBM-BF
acetone	Sigma Aldrich	270725
isopropyl alcohol	Sigma Aldrich	563935
HEK cells	LGC standards srl	ATCC-CRL-1573
HEPES	Sigma Aldrich	H0887
PBS	Sigma Aldrich	P5244
E-MEM	LGC standards srl	ATCC-30-2003
EDTA	Sigma Aldrich	E8008-
FBS	LGC standards srl	ATCC-30-2020