Оптический контроль живых клеток электрической активности по сопряженных полимеров

Summary

A method for stimulation of in-vitro cell cultures electrical activity with visible light, based on the use of organic semiconducting polymers is described.

Abstract

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated polymers display several optimal properties as substrates for biological systems, such as good biocompatibility, excellent mechanical properties, cheap and easy processing technology, and possibility of deposition on light, thin and flexible substrates. These materials have been employed for cellular interfaces like neural probes, transistors for excitation and recording of neural activity, biosensors and actuators for drug release. Recent experiments have also demonstrated the possibility to use conjugated polymers for all-optical modulation of the electrical activity of cells. Several in-vitro study cases have been reported, including primary neuronal networks, astrocytes and secondary line cells. Moreover, signal photo-transduction mediated by organic polymers has been shown to restore light sensitivity in degenerated retinas, suggesting that these devices may be used for artificial retinal prosthesis in the future. All in all, light sensitive conjugated polymers represent a new approach for optical modulation of cellular activity.

In this work, all the steps required to fabricate a bio-polymer interface for optical excitation of living cells are described. The function of the active interface is to transduce the light stimulus into a modulation of the cell membrane potential. As a study case, useful for in-vitro studies, a polythiophene thin film is used as the functional, light absorbing layer, and Human Embryonic Kidney (HEK-293) cells are employed as the biological component of the interface. Practical examples of successful control of the cell membrane potential upon stimulation with light pulses of different duration are provided. In particular, it is shown that both depolarizing and hyperpolarizing effects on the cell membrane can be achieved depending on the duration of the light stimulus. The reported protocol is of general validity and can be straightforwardly extended to other biological preparations.

Introduction

Возможность манипулировать клеточную активность с точным пространственным и временным разрешением представляет собой ключевой стратегии в Нейрологическая исследований и в лечении неврологических и психиатрических расстройств. ¹ Традиционные методы основаны на электрической стимуляцией клетки с использованием электродов, расположенных в непосредственной близости или в контакте с целевая система, ^2, которые могут быть различной сложности (одной ячейке сотовой сети, срезах мозга, в естественных условиях тканях мозга). В прошлом веке, использование патч-зажим, металла и подложки интегрированных электродов обеспечили детальную картину физиологии и патофизиологии отдельных нейронов и функционирования механизмов нейронных сетей. Тем не менее, электрическая стимуляция страдает от важных ограничений. Первый из них связан с целом плохой пространственной разрешающей из-за физических размеров электродов и их фиксированной геометрии, которые не могут быть легко адаптированыдо сложных организованных систем, таких как биологические ткани. Кроме того, проблемы, связанные с сопротивлением электродов и перекрестных помех между стимуляции и записи систем может ухудшить отношения сигнал-шум измерений. ³ С другой стороны, использование света для стимуляции может помочь преодолеть многие ограничения электрической подхода. Прежде всего, это обеспечивает беспрецедентную пространственные (<1 мкм) и временным разрешением (<1 мс), что делает возможным для решения конкретных типов клеток или даже суб-клеточных отсеков. Кроме того, он обладает высокой неинвазивным, поскольку он позволяет избежать физического контакта с интересующей ткани и расчесываются стимуляции от записи. Кроме того, как интенсивность света и длина волны может быть точно регулируется и, таким образом различные протоколы стимуляции может быть применен. ^3,4

Тем не менее, подавляющее большинство клеток животных не представляют какой-либо конкретной чувствительность к свету. Несколько стратегий для оптического stimulatioп Таким образом, было предложено, либо используя светочувствительные молекулярные медиаторы поблизости или в клетках, или с помощью светочувствительного устройство, размещенное снаружи, близко к клетке. Первая категория относится к эндогенным механизмам, как стимулирование через видимого или инфракрасного (ИК) света, а также использование либо photoisomerizable / действием света соединений или генетической экспрессии фоточувствительных молекул приводов (оптогенетика). Последнее класс включает методы экзогенной стимуляции достигается при использовании неорганических нано / микрочастиц или фоторезисторов кремниевых подложках. ⁵ Тем не менее, все эти системы имеют светлые стороны и недостатки. В частности, эндогенной поглощение клетками в видимом диапазоне слаба и не надежны, и сопутствующее образование активных форм кислорода может быть вредным для ячейки. В общем, ИК используется для индукции местного теплового нагрева из-за поглощения воды, но коэффициент экстинкции воды мало, что требует улРонг инфракрасный свет (от десятков до сотен Вт / мм ^2), что трудно поставить через стандартные оптики микроскопа и могут представлять проблемы безопасности для в естественных приложений. С другой стороны, фото-переключаемые останов соединения имеют времени ограниченные меры и часто требуют УФ-света, который трудно доставить из-за ограниченного проникновения в ткани. Кроме того, они страдают от диффузии проблем активированных соединений на фотолиза за пределами освещенной области. Наконец, optogenetic инструменты позволили ученым цель специфический клеточный субпопуляции и суб-купе и быстро становится одним из ключевых технологий в Нейрологическая исследований. Тем не менее, вставив экзогенный фрагмент ДНК с помощью вирусного вектора поднимает важные вопросы безопасности, особенно в связи с принятием на больных людей. ^5,6 По этим причинам, исследования новых материалов и устройств, способных клеток оптической манипуляции является чрезвычайно актуальной.

Недавно романподход, основанный на использовании светочувствительных сопряженных полимеров, способных эффективно преобразовывать оптический стимул в модуляции электрической активности клеток, было предложено. Сотовый Стимуляция Polymer фотовозбуждения (CSPP) метод использует множество ключевых включение черты, характерные для органических полупроводников: они неразрывно чувствительны к свету в видимом диапазоне; ⁷ они являются биологически совместимыми, мягкой и послушной, и их механическая гибкость позволяет интимную интерфейс с тканью как в пробирке и в естественных условиях ^8-10. Кроме того, они могут быть легко функционализированные лучше адаптироваться к интерфейсу с живыми клетками, и для того, чтобы конкретный возбуждение, зондирующего и чувствительный возможности. ^11,12 Более того, они поддерживают электронного, а также ионного транспорта, что делает их идеальными для комбинации из электроники объявления биологии. ^13,14 Интересно, они могут работать в режиме фотоэлектрической, избегая необходимость применения внешнего смещения Fили эффективность ячейки оптического возбуждения. ¹⁵

Надежность CSPP техники ранее было показано, в нескольких системах, в том числе первичных нейронов, астроцитов ^15,16, 17 средних клеточных линий ^{18 и} эксплантированных сетчатки тканей. ¹⁶ В этой работе, все шаги, необходимые для изготовления светочувствительного полимера био- Интерфейс ¹⁹ для оптического стимуляции в пробирке систем описаны в деталях. В случае исследования, прототипом органического фотоэлектрических смеси региона-регулярной поли (3-hexylthiophene) (RR-P3HT), функционирующего в качестве донора электронов, и фенил-C61-бутановой кислоты метиловый эфир (PCBM), выступая в качестве используется акцептор электронов. В биологической системы, используют человека эмбриональной почки (НЕК-293) клеток. Пример протокола фотостимуляции с относительной записи активности клеток через электрофизиологических измерений обеспечивается.

Описанный платформаОднако общее значение, и оно может быть легко расширена для использования других полимеров сопр (путем правильной настройки процесса Получение раствора и параметров осаждения), различные типы клеток (путем соответствующего изменения протокола для культивирования клеток, покрытие процедуру и время требуемый для посева клеток и пролиферации) и различных протоколов стимуляции (длина волны света, стимулы частота и продолжительность, плотности фотовозбуждение).

Protocol

1. Подготовка подложек фотоактивные Подготовьте P3HT: решение PCBM (1: 1 / в) в хлорбензоле при концентрации P3HT 20 г / л. Смешайте раствор с помощью магнитной мешалки в течение по крайней мере 4 ч при 60 ° С. Рассмотрим объемом 150 мкл раствора субстрата для каждого быть готовым. Чистые ITO п…

Representative Results

Клетки могут быть легко культивировали на P3HT: PCBM субстратов, при условии, что подходящая адгезионный слой осаждается (как фибронектин, используемого на стадии 3.2, описанной протокола). P3HT: PCBM пики оптического поглощения в зеленой части видимого спектра; Однако другие с?…

Discussion

Критические шаги отчетный протокол для в пробирке оптического стимуляция клеток, главным образом, касаются выбор светочувствительного полимера, параметры тепловых стерилизации, интенсивность и продолжительность световых раздражителей. P3HT: PCBM тонкая пленка была выбрана здесь, т…

Materials

rr-P3HT	Sigma Aldrich	698989-5G
ITO-coated substrates	Nano-CS	IT10300100
Fibronectin	Sigma Aldrich	F1141
chlorobenzene	Sigma Aldrich	319996
PCBM	Nano-C	Nano-CPCBM-BF
acetone	Sigma Aldrich	270725
isopropyl alcohol	Sigma Aldrich	563935
HEK cells	LGC standards srl	ATCC-CRL-1573
HEPES	Sigma Aldrich	H0887
PBS	Sigma Aldrich	P5244
E-MEM	LGC standards srl	ATCC-30-2003
EDTA	Sigma Aldrich	E8008-
FBS	LGC standards srl	ATCC-30-2020