Control óptico de células vivas Actividad Eléctrica por conjugadas Polímeros
Summary
A method for stimulation of in-vitro cell cultures electrical activity with visible light, based on the use of organic semiconducting polymers is described.
Abstract
Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated polymers display several optimal properties as substrates for biological systems, such as good biocompatibility, excellent mechanical properties, cheap and easy processing technology, and possibility of deposition on light, thin and flexible substrates. These materials have been employed for cellular interfaces like neural probes, transistors for excitation and recording of neural activity, biosensors and actuators for drug release. Recent experiments have also demonstrated the possibility to use conjugated polymers for all-optical modulation of the electrical activity of cells. Several in-vitro study cases have been reported, including primary neuronal networks, astrocytes and secondary line cells. Moreover, signal photo-transduction mediated by organic polymers has been shown to restore light sensitivity in degenerated retinas, suggesting that these devices may be used for artificial retinal prosthesis in the future. All in all, light sensitive conjugated polymers represent a new approach for optical modulation of cellular activity.
In this work, all the steps required to fabricate a bio-polymer interface for optical excitation of living cells are described. The function of the active interface is to transduce the light stimulus into a modulation of the cell membrane potential. As a study case, useful for in-vitro studies, a polythiophene thin film is used as the functional, light absorbing layer, and Human Embryonic Kidney (HEK-293) cells are employed as the biological component of the interface. Practical examples of successful control of the cell membrane potential upon stimulation with light pulses of different duration are provided. In particular, it is shown that both depolarizing and hyperpolarizing effects on the cell membrane can be achieved depending on the duration of the light stimulus. The reported protocol is of general validity and can be straightforwardly extended to other biological preparations.
Introduction
La posibilidad de manipular la actividad celular con una resolución espacial y temporal precisa representa una estrategia clave en la investigación neurocientífica y en el tratamiento de trastornos neurológicos y psiquiátricos. 1 Los métodos tradicionales se basan en la estimulación eléctrica de las células utilizando electrodos colocados en la proximidad o en contacto con el sistema de destino, 2 que puede ser de diferente complejidad (una sola célula, red celular, rodajas de cerebro, in vivo tejidos cerebrales). Durante el siglo pasado, el uso de patch-clamp, metal y electrodos de sustrato integrado han proporcionado una imagen detallada de la fisiología y la fisiopatología de las neuronas individuales y de los mecanismos de funcionamiento de las redes neuronales. Sin embargo, la estimulación eléctrica sufre de limitaciones importantes. La primera de ellas está relacionada con una generalmente pobre resolución espacial debido a las dimensiones físicas de los electrodos y su geometría fija, que no se pueden adaptar fácilmentea los sistemas organizados complejos como los tejidos biológicos. Además, los problemas relacionados con la impedancia de los electrodos y de la diafonía entre los sistemas de estimulación y de registro se pueden deteriorar la relación final de señal a ruido de las mediciones. 3 Por otro lado, el uso de la luz para la estimulación puede ayudar a superar muchas limitaciones del enfoque eléctrica. En primer lugar, ofrece espacial sin precedentes (<1 m) y la resolución temporal (<1 ms), por lo que es posible dirigir tipos de células específicas e incluso compartimentos de células sub. Además, es altamente no invasivo ya que evita cualquier contacto físico con el tejido de interés y desenreda la estimulación de grabación. Además, tanto la intensidad de luz de longitud de onda y se pueden regular con precisión y por lo tanto diversos protocolos de estimulación se pueden aplicar. 3,4
Sin embargo, la gran mayoría de las células animales no presentan ninguna sensibilidad específica a la luz. Varias estrategias para stimulatio óptican por lo tanto se han propuesto, ya sea explotando mediadores moleculares sensibles a la luz cerca o dentro de las células, o el uso de dispositivo de fotoactivo colocado externamente, cerca de la célula. La primera categoría se refiere a los mecanismos endógenos como el estímulo a través de (IR) de luz visible o infrarroja, así como el uso de cualquiera de los compuestos fotoisomerizables / fotoescindible o la expresión genética de los actuadores moleculares fotosensibles (optogenética). La última clase incluye técnicas para la estimulación exógena logrado con el uso de nano / micro-partículas inorgánicas o sustratos de silicio fotoconductores. 5 Sin embargo, todos estos sistemas tienen lados brillantes e inconvenientes. En particular, la absorción endógena de las células en el rango visible es débil y no fiable, y la generación concomitante de especies reactivas de oxígeno puede ser perjudicial para la célula. En general, IR se utiliza para inducir el calentamiento térmico local debido a la absorción de agua, pero el coeficiente de extinción de agua es pequeño, por lo que requiere stluz infrarroja rong (de decenas a cientos de W / mm 2), que es difícil de administrar a través de la óptica del microscopio estándar y puede plantear problemas de seguridad para aplicaciones en vivo. Por otra parte, los compuestos de introducción en jaulas foto-conmutable tienen una acción limitada en el tiempo y, a menudo requieren de luz UV que es difícil de entregar debido a la penetración de tejido limitado. Además sufren de problemas de difusión de los compuestos activados sobre la fotólisis fuera de la zona iluminada. Por último, las herramientas de optogenética han permitido a los científicos para apuntar subpoblación celular específica y sub-compartimientos y están emergiendo rápidamente como una de las tecnologías clave en la investigación neurocientífica. Sin embargo, la inserción de un segmento de ADN exógeno a través de un vector viral plantea problemas de seguridad importantes, sobre todo en vista de la adopción en pacientes humanos. 5,6 Por estas razones, la investigación sobre nuevos materiales y dispositivos capaces de manipulación óptica celular es un tema muy caliente.
Recientemente, una novela, se ha propuesto enfoque basado en el uso de polímeros conjugados sensibles a la luz, capaces de transducir eficientemente un estímulo óptico en una modulación de la actividad eléctrica celular. La estimulación de células por Polymer fotoexcitación (CSPP) técnica explota muchas características clave que permite típica de los semiconductores orgánicos: son intrínsecamente sensible a la luz en el rango visible; 7 que son biocompatibles, suave y conformable, y su flexibilidad mecánica permite una interfaz íntimo con el tejido tanto in vitro e in vivo 8-10. Aparte de eso, pueden ser fácilmente funcionalizados para adaptarse mejor a la interfaz con las células vivas, y para permitir la excitación específica, sondeo y detección de capacidades. 11,12 Además, soporte electrónico, así como el transporte iónico, lo que es ideal para la combinación del anuncio de la electrónica de la biología. 13,14 Curiosamente, pueden trabajar en modo fotovoltaico, evitando la necesidad de aplicar un sesgo f exterioro la estimulación óptica celular eficiente. 15
La fiabilidad de la técnica CSPP se ha demostrado previamente en varios sistemas, incluyendo las neuronas primarias, 15,16 astrocitos, 17 líneas de células secundarias 18 y los tejidos de la retina explantadas. 16 En este trabajo, todas las medidas necesarias para fabricar un bio-polímero sensible a la luz interfaz 19 para la estimulación óptica de los sistemas in vitro se describen en detalle. Como caso de estudio, una mezcla fotovoltaica orgánica prototípico de la región regulares poli (3-hexiltiofeno) (rr-P3HT), que funciona como el donador de electrones, y éster fenil-C61-butírico-ácido-metilo (PCBM), que actúa como el se emplea aceptor de electrones. A medida que el sistema biológico, se usan células embrionarias humanas de riñón (HEK-293). Se proporciona un ejemplo de un protocolo fotoestimulación con la grabación relativa de la actividad celular a través de mediciones electrofisiológicas.
La plataforma descritaSin embargo, es de validez general, y se puede extender fácilmente a la utilización de otros polímeros conjugados (ajustando correctamente el proceso de solución de la preparación y los parámetros de deposición), diferentes tipos de células (cambiando adecuadamente el protocolo de cultivo celular, procedimiento y tiempo solicitado chapado para la siembra y la proliferación celular) y diferentes protocolos de estimulación (longitud de onda de luz, de frecuencia estímulos y duración, densidad fotoexcitación).
Protocol
Representative Results
Discussion
Los pasos críticos del protocolo reportado para in vitro estimulación óptica de células concierne principalmente la elección del polímero sensible a la luz, los parámetros de esterilización térmica, la intensidad y la duración de los estímulos luminosos. Un P3HT: película delgada PCBM fue seleccionado aquí, ya que garantiza una buena estabilidad temporal y electroquímica. Sin embargo, hay que notar que no todos los polímeros sensibles a la luz pueden ofrecer interpretaciones analógicas, 22<…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The work was supported by EU through project FP7-PEOPLE-212-ITN 316832-OLIMPIA,
Telethon – Italy (grants GGP12033 and GGP14022), Fondazione Cariplo (grant ID 2013-0738).
Materials
| rr-P3HT | Sigma Aldrich | 698989-5G | |
| ITO-coated substrates | Nano-CS | IT10300100 | |
| Fibronectin | Sigma Aldrich | F1141 | |
| chlorobenzene | Sigma Aldrich | 319996 | |
| PCBM | Nano-C | Nano-CPCBM-BF | |
| acetone | Sigma Aldrich | 270725 | |
| isopropyl alcohol | Sigma Aldrich | 563935 | |
| HEK cells | LGC standards srl | ATCC-CRL-1573 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H0887 | |
| PBS | Sigma Aldrich | P5244 | |
| E-MEM | LGC standards srl | ATCC-30-2003 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E8008- | |
| FBS | LGC standards srl | ATCC-30-2020 |
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