This article describes a method for generating a reproducible spinal cord compression injury (SCI) in the neonatal mouse. The model provides an advantageous platform for studying mechanisms of adaptive plasticity that underlie spontaneous functional recovery.
脊髄損傷(SCI)は、典型的には、特に脊髄脳から下降繊維に損害を与えて、壊滅的な神経障害を引き起こします。研究の主要な現在の面積は、SCI後の自発的または誘導された機能回復の根底に適応可塑性のメカニズムに焦点を当てています。自発的な機能回復は、脊髄が発展するようにどのように適応可塑性の変化についての興味深い疑問を提起、初期の生活の中で大きいことが報告されています。このダイナミックの調査を容易にするために、我々は、新生児マウスにおけるSCIモデルを開発しました。モデルが少なすぎる検討されている小児SCIのための関連性を持っています。成人における神経可塑性は、人生の早い段階1における神経可塑性と同様のメカニズムの一部を含むので、このモデルは、潜在的に大人SCIのためにも、いくつかの関連性を有することができます。ここでは、新生児マウスで再現性の脊髄圧迫(SCC)の損傷を生成するための全体手順を説明します早ければ生後(P)などの1日目SCC(ここでは胸椎レベル9-11で説明)指定された脊髄レベルで椎弓切除術を行った後、急速に脊髄を圧迫し、解凍するように変更Yasargil瘤ミニクリップを使用することによって達成されます。前述のように、損傷した新生仔マウスは、行動障害について試験または電気生理学的および高スループットの光記録技術1を用いて、シナプス接続のex vivoでの生理学的分析のために犠牲にすることができます。行動や生理的評価を使用して、以前と現在進行中の研究では、2週間以内に完了機能回復、および識別されたシナプス結合1を下降のレベルで機能回路の変化の最初の証拠が続く後肢運動性の劇的な、急性障害を実証しました。
During the last decade, increasing evidence obtained from different spinal cord injury (SCI) models has shown that spinal networks can reorganize spontaneously to contribute to functional recovery1-9. Adaptive plasticity has as a consequence become an important topic in SCI research. It has been shown that plasticity encompasses regrowth of spared axons, sprouting of new axon collaterals and the formation of novel synaptic connections. Much of this knowledge has been obtained from behavioral or anatomical studies in adult animals. An important limitation of adult spinal cord studies is the difficulty of performing high-throughput physiological assessment, which is easier in neonatal preparations1. One major difference is that wholemount ex vivo preparations of the adult brainstem and spinal cord have low viability. Another is that adult spinal tissue is more opaque to light because it is thicker and myelinated. Although recent advances in in vivo imaging (see for example, 10-12) may partially overcome these problems, the possibility of performing high throughput imaging at any desired dorsoventral depth at multiple sites along a given brainstem-spinal cord preparation is currently only feasible in neonates. The immature state of axon myelination in the neonatal spinal cord facilitates high-throughput ex vivo optical recording, thus permitting a dynamic assessment of functional synaptic connections13-17. Combined with genetically encoded calcium reporters and optogenetic stimulation and pharmacology tools, optical approaches can contribute to a deeper understanding of the mechanisms underlying adaptive plasticity.
It is estimated that between 1-10% of all spinal cord injuries affect infants and children18-22. In contrast to adult SCI the pathogenesis and potential for spontaneous recovery in pediatric SCI is less studied. Using a neonatal SCI model can therefore provide more insight into pediatric SCI and contribute to a better understanding of the pathogenetic and recovery mechanisms involved. Moreover, post-SCI plasticity supporting functional recovery in the adult spinal cord is believed to involve at least in part the same mechanisms that govern the development of the central nervous system such as axon growth, branching and formation of new synapses23-26. Thus, using a neonatal SCI model could provide important insights into mechanisms that are also operative in the adult spinal cord, or that could potentially be reinstated in the adult spinal cord (for example by implantation of fetal cells or tissue or of tissue constructed de novo from pluripotent stem cells) to facilitate recovery.
The neonatal mouse thus provides a platform for an integrative, multi-methodological approach to investigating adaptive plasticity following spinal cord injury, in which a combination of behavioral, physiological, anatomical, molecular and genetic methods can be readily employed. Establishing standardized neonatal injury models is an important step in implementing such studies.
この記事では、P1マウスのクリップで生成されたSCC損傷のための手順が記載されています。同じ手順は、後の段階で行うことができます。圧縮損傷はP5、P7、P9およびP12(Züchner、 ら 、原稿準備中)で正常に実行されました。すべての出生後の段階では、全身麻酔は、純酸素中で気化イソフルランで得られるが、麻酔結果は年齢に大きく依存します。局所麻酔をプロトコルに導入される前に、P1-P4での初期の試みでは、不十分な鎮静および過剰摂取の間の狭い用量効果ウィンドウによる深いと長期の鎮静を得ることは困難でした。また、新生動物におけるイソフルランの神経毒性効果に関連する懸念は27-30を提起されています。 2-3倍のイソフルラン線量低減を可能にしながら、イソフルランとより深く、より安定した麻酔中の局所麻酔薬ブピバカイン結果の組み合わせ。 anesthe異なるタイプのSIAは31,32 cryoanesthesia含め、新生児げっ歯類のために記載されているが、cryoanesthesiaの1の潜在的な不便さは、効率的かつ再現性の損傷の発生を複雑にし得る(33,34によってレビュー)その神経保護効果を、です。バルビツール酸系麻酔が原因成人35,36よりも血清アルブミンおよび体脂肪の低いレベルに新生仔マウスでより低い効率を有すると考えられます。
非常に侵襲的および外傷が手順が確立されると、手術中の死亡率は低いです。しかし、手術マウスの回復および生存率を改善するために、特に注意が必要な手順の間の重要なステップがあります。一つの重要な問題は、手術を生き残るために最善の機会を持つことになります子犬を選択することです。ごみが大きい場合は、個々の仔の栄養状態が変化します。手術中に起こる避けられない出血に加えて、操作子犬は時間を過ごします離れて母親からだ、と彼らはしばしば翌朝前に牛乳を飲みません。すでに胃内乳の一定量を有する仔を選択することが有利です。これは、P0からP7に腹部の皮膚を通して容易に見ることができます。
最初の夜の間に操作子犬が母親によってcannibalizedされているの偉大な危険にさらされています。このモデルの初期の開発中に、より操作したマウスの半数以上は、ケージ内の血液の明確な兆候で、翌朝欠落していました。げっ歯類でNecrophagy、共食いと嬰児は何十年も37から40のために研究されてきました。本研究では、共食いは一度だけ目撃したが、ケージに戻した子犬は、夜の間に自然の原因によって死が起こりそう見えたような良い形で、一般的であったためnecrophagyよりも可能性のある説明と考えられました。これは、不安や攻撃性私を減らすためにジアゼパムなどの可逆薬剤を使用するという考えを促しましたn個(41によってレビュー)母。ジアゼパムの腹腔内注射を大幅に超える60%から20%未満に最初の夜の間に死亡率を落とし、状況を改善しました。
術後の復帰以下のできるだけごみを淘汰し、妨害することにより、ごみのサイズを小さくする手術動物に利益をもたらすことができる追加要素です。しかし、母親と一緒にのみ操作仔を残すことは有益ではありません。 /操作無操作仔のベストバランスはラインに応じて異なりますが、3-4未手術の子犬と一緒に4-5操作仔(傷害または偽)を残しICRおよびSCID-ICRマウスのために最良の結果が得られたことがあります。
一般的な意味では、この新生児のSCIモデルの主な制限は、新生児脊髄は、成人の脊髄から多くの点で異なり、したがって、成人のSCIモデルから得られたものに匹敵する実験結果を提供しないことです。このような違いは、全体のサイズが含まれており、過小表現例えば、乏突起膠細胞、未成熟な免疫応答および未熟神経回路などの特定の細胞型の脊髄の量、細胞数、。このモデルでの実験から導かれた結論は、したがって、慎重に検討する必要があります。一方、モデルは、小児SCIの比較的少ない調べシナリオに関連します。また、大人のSCIモデルに対する明白な弱点は、それが復活した場合、成人の脊髄における最低限現存するものの、治療基板を表すことができる、可塑性のメカニズムの解明を可能にすることができるように潜在的な強度もあります。新生児あるいは胚の状態の回復があまり発達した細胞または組織の移植によって、または以前の発達特性を持つ成体組織を生じる試薬で処理することによって実施することができると考えられます。ニューロン周囲網を除去するために酵素を使用すると、後者のアプローチ42,43の一例です。
<p class="「jove_content" "> SCIの動物モデルを確立する主要な問題は、標準化された傷害を得ることです。これは、複数のSCIモデルで対処されている例は 、離断は、片側切断は、インパクター、デバイスに影響を与えるに関してなどバルーン圧縮、鉗子クラッシュ、静的重量の圧縮は、この方向での努力がでSCIモデルをもたらした重要な側面でありますこのようなスピード、力と持続時間などの影響の複数のパラメータを操作することができる大人のげっ歯類(44によってレビュー)。別のアプローチは、以下の機器を含む、カーロッキードの動脈瘤クリップ45,46の変形例を採用しています。インパクターは、クリップ模倣同時虚血のある程度で圧迫損傷に対し、挫傷を模倣これらの2のアプローチは相補的です。そのため、実質的なサイズの制約および新生児マウスの大きい脆弱性を、より高い死亡率は、長い手術と同様のdevelのコストに関連付けられています小さい規模の装置を途上、それがインパクターで生成された挫傷のアプローチではなくクリップで生成された圧縮を開発するために選ばれました。これは、新生児のマウス1の脊柱のサイズに適応するように商業的に入手可能な動脈瘤ミニクリップを適合させることにより達成されました。ストッパーを追加すると、標準化された圧縮幅を保証し、そして限り、クリップの張力がストッパーの限界まで圧縮するよう、最小限の幅で静的フェーズの間の圧縮の力が少し変化すべきです。これは、その寿命にわたってクリップ張力が変化するにつれて変化しますので、どのような標準化されていないことは、そのダイナミックなフェーズ中の圧縮の速度です。圧縮の静的位相がダイナミック位相よりもはるかに長く続き、脊髄組織は、ミニクリップブレードに対する反の多く発揮することを示唆することはほとんどありませんように、損傷の重症度は、に最も依存している可能性があり静的位相。しかしながら、これは、試験されていません。損傷重症度は、静的圧縮力及び持続時間、圧縮および伸張の速度、ミニクリップの位置、同じサイトで実行圧迫の数を含む複数の要因に依存する可能性があります。したがって、これらのパラメータの組み合わせの変動が弱いから重度の負傷の重大度のスペクトルの発生につながる可能性があります。変動の潜在的にもかかわらず、私たちの以前に発表された研究1で、我々は組織学的、生理学的および行動のレベルで一貫性のある結果を得たので、許容可能な標準化が達成することは困難であることを示唆することはほとんどないです。私たちは、その研究で我々は、図5に示すような空気ステッピングなどの行動テストを含めて、各レベルでの検証の複数のメソッドを使用することに注意してください。この新生児のSCIモデルでは傷害は、軸索の一定割合を惜しみ、それによって再modelinを通じて適応可塑性を誘発するための有利な状況を提供します免れ接続と新たな回路の形成のグラム。新生児マウスは、多くの実験方法による調査に適していますので、逆行し、順行性軸索トレース、免疫組織化学、電気生理学および高、行動テストを含む統合的なアプローチ、との機能回復と適応可塑性を研究するためにこのモデルを使用することが可能です-throughput光記録1。一例として、我々は、脳幹および脊髄損傷1のエクスビボホールマウント調製物における高スループットのカルシウムイメージングを使用して、特定の下り入力のレベルでネットワーク再モデリングを実証するために、この統合的アプローチを利用しました。これは、脊髄神経細胞の特定の亜集団間のシナプス結合の再形成を評価するために神経光遺伝学および光遺伝学薬理学ツールを使用して、さらに押し込むことができます。
The authors have nothing to disclose.
This work has been supported by grants from the South-Eastern Norway Regional Health Authority (JLB, 2014119; JCG, project numbers 2015045 and 2012065), by the Norwegian Research Council (JCG, project number 23 00 00) and the University of Oslo.
Plastic seringe (30 or 50 mL) | |||
Plastic petri dish (150x25mm) | |||
Fortec isoflurane vaporizer | Cyprane | We use and old device out of production, check the link for newer device | |
Yasargil temporary aneurysm mini-clip | Æsculap | FE681K | |
Fine -Bore Polyethylene tubing ID 0.58mm, OD 0.96mm | Smiths Medical | 800/100/200 | |
Isoflurane (Forene) | Abbott GmbH & Co. KG | ||
Marcain (Bupivacain) | AstraZeneca | ||
Insuline seringe 0.3ml 30Gx8mm | VWR | 80086-442 | |
Ultra Fine Micro Knife 5mm cutting edge | Fine Science Tools | 10315-12 | |
Extra Fine Graefe Forceps – 0.5mm Tip | Fine Science Tools | 1153-10 | Not really necessary, often the teeth are too large |
Forceps SuperGrip Straight | Fine Science Tools | 00632-11 | Two forceps are necessary |
Spongostan Special 70 x 50 x 1 mm | Ferrosan | ||
Vannas Spring Scissors – 2mm Blades Straight | Fine Science Tools | 15000-03 | |
Vario Clip Applying Forceps | Aesculap | FE502T | |
Vicryl 6–0 (Ethicon) | Johnson and Johnson | J105G | |
Diethrich micro needle holder | 11-510-20 | ||
Temgesic (buprenorphine) | Schering-Plough | ||
Stesolid (diazepam) | Actavis | Also known as Valium | |
Pedamix | Fresenius Kabi | ||
Klorhexidinsprit (chlorhexidine gluconate) | Fresenius Kabi | D08A C02 |