एक नवजात माउस रीढ़ की हड्डी संपीड़न चोट मॉडल
Summary
This article describes a method for generating a reproducible spinal cord compression injury (SCI) in the neonatal mouse. The model provides an advantageous platform for studying mechanisms of adaptive plasticity that underlie spontaneous functional recovery.
Abstract
स्पाइनल कॉर्ड चोट (एससीआई) आम तौर पर विशेष रूप से मस्तिष्क से रीढ़ की हड्डी को उतरते तंतुओं को नुकसान के माध्यम से, विनाशकारी न्यूरोलॉजिकल घाटा कारण बनता है। शोध के एक प्रमुख वर्तमान क्षेत्र अनुकूली प्लास्टिसिटी का तंत्र है कि एससीआई निम्नलिखित सहज या प्रेरित कार्यात्मक वसूली आबाद पर केंद्रित है। उठना, कार्यात्मक वसूली कैसे अनुकूली प्लास्टिसिटी परिवर्तन रीढ़ की हड्डी के रूप में विकसित के बारे में दिलचस्प सवाल उठाने जीवन में अधिक से अधिक जल्दी होने की सूचना है। इस गतिशील की जांच की सुविधा के लिए, हम नवजात माउस में एक विज्ञान मॉडल विकसित किया है। मॉडल बाल चिकित्सा एससीआई, जो बहुत कम अध्ययन किया जाता है के लिए प्रासंगिक है। क्योंकि वयस्क में तंत्रिका प्लास्टिसिटी प्रारंभिक जीवन 1 में तंत्रिका plasticity के रूप में ही तंत्र के कुछ शामिल है, इस मॉडल संभावित वयस्क एससीआई के लिए भी कुछ प्रासंगिकता हो सकती है। यहाँ हम नवजात माउस में एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य रीढ़ की हड्डी संपीड़न (एससीसी) चोट पैदा करने के लिए पूरी प्रक्रिया का वर्णनके रूप में जल्दी के रूप में प्रसव के बाद (पी) दिन 1. एससीसी एक दिया रीढ़ की हड्डी के स्तर पर एक laminectomy प्रदर्शन से हासिल की है और उसके बाद (यहाँ वक्ष के स्तर को 9-11 पर वर्णित) एक संशोधित Yasargil धमनीविस्फार मिनी क्लिप का उपयोग तेजी से सेक और रीढ़ की हड्डी दबाव हटाना । पहले से वर्णित के रूप में, घायल नवजात चूहों व्यवहार घाटे के लिए परीक्षण या electrophysiological और उच्च throughput ऑप्टिकल रिकॉर्डिंग तकनीकों का उपयोग करते हुए 1 synaptic कनेक्टिविटी के पूर्व vivo शारीरिक विश्लेषण के लिए बलिदान किया जा सकता है। इससे पहले चल रही है और व्यवहार और शारीरिक आकलन का उपयोग अध्ययन hindlimb गतिशीलता का एक नाटकीय, तीव्र हानि 2 हफ्तों के भीतर एक पूरा कार्यात्मक वसूली के द्वारा पीछा किया, और पहचान synaptic कनेक्शन 1 उतरते के स्तर पर कार्यात्मक circuitry में परिवर्तन का पहला सबूत प्रदर्शन किया है।
Introduction
During the last decade, increasing evidence obtained from different spinal cord injury (SCI) models has shown that spinal networks can reorganize spontaneously to contribute to functional recovery1-9. Adaptive plasticity has as a consequence become an important topic in SCI research. It has been shown that plasticity encompasses regrowth of spared axons, sprouting of new axon collaterals and the formation of novel synaptic connections. Much of this knowledge has been obtained from behavioral or anatomical studies in adult animals. An important limitation of adult spinal cord studies is the difficulty of performing high-throughput physiological assessment, which is easier in neonatal preparations1. One major difference is that wholemount ex vivo preparations of the adult brainstem and spinal cord have low viability. Another is that adult spinal tissue is more opaque to light because it is thicker and myelinated. Although recent advances in in vivo imaging (see for example, 10-12) may partially overcome these problems, the possibility of performing high throughput imaging at any desired dorsoventral depth at multiple sites along a given brainstem-spinal cord preparation is currently only feasible in neonates. The immature state of axon myelination in the neonatal spinal cord facilitates high-throughput ex vivo optical recording, thus permitting a dynamic assessment of functional synaptic connections13-17. Combined with genetically encoded calcium reporters and optogenetic stimulation and pharmacology tools, optical approaches can contribute to a deeper understanding of the mechanisms underlying adaptive plasticity.
It is estimated that between 1-10% of all spinal cord injuries affect infants and children18-22. In contrast to adult SCI the pathogenesis and potential for spontaneous recovery in pediatric SCI is less studied. Using a neonatal SCI model can therefore provide more insight into pediatric SCI and contribute to a better understanding of the pathogenetic and recovery mechanisms involved. Moreover, post-SCI plasticity supporting functional recovery in the adult spinal cord is believed to involve at least in part the same mechanisms that govern the development of the central nervous system such as axon growth, branching and formation of new synapses23-26. Thus, using a neonatal SCI model could provide important insights into mechanisms that are also operative in the adult spinal cord, or that could potentially be reinstated in the adult spinal cord (for example by implantation of fetal cells or tissue or of tissue constructed de novo from pluripotent stem cells) to facilitate recovery.
The neonatal mouse thus provides a platform for an integrative, multi-methodological approach to investigating adaptive plasticity following spinal cord injury, in which a combination of behavioral, physiological, anatomical, molecular and genetic methods can be readily employed. Establishing standardized neonatal injury models is an important step in implementing such studies.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस लेख में P1 चूहों में एक क्लिप जनित एससीसी की चोट के लिए प्रक्रियाओं वर्णित हैं। एक ही प्रक्रिया भी बाद के चरणों में किया जा सकता है। संपीड़न चोटों पी -5, P7, P9 और P12 (Züchner, एट अल।, तैयारी में पांडुलिपि) में सफलतापूर्वक प्रदर्शन किया गया। सभी प्रसव के बाद के चरणों में, सामान्य संज्ञाहरण शुद्ध ऑक्सीजन में वाष्पीकृत isoflurane साथ प्राप्त की है, लेकिन संवेदनाहारी परिणाम उम्र पर बहुत निर्भर करता है। P1-पी 4 में आरंभिक प्रयास में, इससे पहले स्थानीय संज्ञाहरण प्रोटोकॉल में पेश किया गया था, यह एक गहरी और लंबे समय तक बेहोश करने की क्रिया को प्राप्त करना कठिन अपर्याप्त बेहोश करने की क्रिया और अधिक मात्रा के बीच एक संकीर्ण खुराक प्रभाव खिड़की के कारण था। इसके अलावा, नवजात पशुओं में isoflurane की एक neurotoxic प्रभाव से संबंधित चिंताओं को 27-30 उठाया गया है। isoflurane की एक संयोजन और एक गहरी और अधिक स्थिर संज्ञाहरण में स्थानीय संवेदनाहारी Bupivacaine परिणाम है, जबकि 2-3 का एक पहलू से एक isoflurane खुराक में कमी की अनुमति है। anesthe के विभिन्न प्रकारएसआईए नवजात मूषक के लिए वर्णित किया गया है, 31,32 cryoanesthesia सहित, लेकिन cryoanesthesia में से एक संभावित असुविधा अपने न्यूरोप्रोटेक्टिव प्रभाव (33,34 द्वारा समीक्षा) है, जो एक कुशल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य चोट की पीढ़ी उलझा सकता है। बार्बीट्युरेट आधारित संज्ञाहरण वयस्कों 35,36 की तुलना में सीरम albumin और शरीर में वसा का स्तर कम होने के कारण नवजात चूहों में कम क्षमता है करने के लिए माना जाता है।
हालांकि काफी आक्रामक और दर्दनाक है, एक बार प्रक्रिया सर्जरी के दौरान मृत्यु दर की स्थापना की है कम है। हालांकि, वहाँ प्रक्रिया के दौरान महत्वपूर्ण कदम है कि विशेष रूप से ध्यान देने की जरूरत वसूली और ऑपरेशन चूहों के अस्तित्व में सुधार करने के लिए कर रहे हैं। एक महत्वपूर्ण मुद्दा पिल्ले कि सर्जरी के जीवित रहने के लिए सबसे अच्छा मौका होगा चयन करने के लिए है। जब कूड़े बड़ी है व्यक्ति पिल्ले के पोषण का राज्य बदलता रहता है। अपरिहार्य खून बह रहा है कि सर्जरी के दौरान होता है के अलावा, संचालित पिल्ले घंटे खर्चमां से दूर है, और वे अक्सर अगली सुबह होने से पहले दूध नहीं पीता। इस प्रकार यह एक फायदा पिल्ले पहले से ही पेट में दूध की एक निश्चित राशि है कि चयन करने के लिए है। यह पेट की त्वचा P0 से P7 के माध्यम से आसानी से दिखाई दे रहा है।
पहली रात के दौरान संचालित पिल्ला मां द्वारा की जा रही cannibalized के महान खतरे में है। संचालित चूहों की तुलना में आधे से अधिक इस मॉडल की प्रारंभिक विकास के दौरान पिंजरे में रक्त के स्पष्ट संकेत के साथ, निम्नलिखित सुबह याद कर रहे थे। Necrophagy, नरभक्षण और कृन्तकों में भ्रूण हत्या दशकों 37-40 के लिए अध्ययन किया गया है। इस अध्ययन में, नरभक्षण केवल एक बार देखा था, लेकिन necrophagy की तुलना में अधिक होने की संभावना स्पष्टीकरण माना जाता था क्योंकि पिल्ले कि पिंजरे में लौट रहे थे जैसे कि अच्छी हालत में आम तौर पर कर रहे थे कि रात के दौरान प्राकृतिक कारणों से मौत असंभव लग रहा था। इस तरह के डायजेपाम के रूप में एक प्रतिवर्ती औषधीय एजेंट का उपयोग चिंता और मैं आक्रामकता को कम करने के विचार के लिए प्रेरित कियाn मां (41 द्वारा समीक्षा)। डायजेपाम के intraperitoneal इंजेक्शन बहुत स्थिति में सुधार हुआ है, कम से कम 20% करने के लिए 60% से अधिक से पहली रात के दौरान मृत्यु दर छोड़ने।
मुर्गियों को मारने और पश्चात की वापसी के बाद कूड़े के रूप में संभव के रूप में छोटे से परेशान द्वारा कूड़े का आकार कम करने के अतिरिक्त तत्वों है कि संचालित जानवरों लाभ प्राप्त कर सकते हैं। हालांकि, मां के साथ ही संचालित पिल्ले छोड़ने फायदेमंद नहीं है। संचालित / unoperated पिल्ले का सबसे अच्छा संतुलन लाइन के अनुसार भिन्न हो सकते हैं, लेकिन 4-5 से संचालित पिल्ले (चोट या नकली) एक साथ छोड़ने 3-4 unoperated पिल्ले के साथ आईसीआर और एस.सी.आई.डी-आईसीआर चूहों के लिए सबसे अच्छा परिणाम दे दी है।
एक सामान्य अर्थ में, यह नवजात एससीआई मॉडल के मुख्य सीमा यह है कि नवजात रीढ़ की हड्डी वयस्क रीढ़ की हड्डी से कई मायनों में अलग है, और इस तरह प्रयोगात्मक परिणाम है कि वयस्क एससीआई मॉडल से प्राप्त उन लोगों के लिए तुलना कर रहे हैं प्रदान नहीं कर सकते है। इस तरह के मतभेद समग्र आकार में शामिल हैं औररीढ़ की हड्डी की मात्रा, सेल नंबर, कम प्रतिनिधित्व ऐसे oligodendrocytes, अपरिपक्व प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और अपरिपक्व neuronal सर्किट के रूप में विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं की। इस मॉडल में प्रयोगों के निष्कर्षों इसलिए ध्यान से विचार किया जाना चाहिए। दूसरी ओर, मॉडल बाल चिकित्सा एससीआई के अपेक्षाकृत कम से जांच परिदृश्य के लिए प्रासंगिक है। इसके अलावा, वयस्क एससीआई मॉडल के संबंध में स्पष्ट कमजोरी भी एक संभावित ताकत यह प्लास्टिसिटी तंत्र है कि, हालांकि वयस्क रीढ़ की हड्डी में न्यूनतम वर्तमान, एक चिकित्सकीय सब्सट्रेट का प्रतिनिधित्व कर सकता है, तो फिर से बहाल की व्याख्या की अनुमति हो सकती है। यह बोधगम्य है कि नवजात या यहां तक कि भ्रूण की स्थिति की बहाली के कम विकसित कोशिकाओं या ऊतक के आरोपण के माध्यम से या अभिकर्मकों कि पहले विकास की विशेषताओं के साथ वयस्क ऊतक पैदा साथ इलाज के द्वारा लागू किया जा सकता है। Perineuronal जाल को खत्म करने एंजाइमों का उपयोग बाद दृष्टिकोण 42,43 का एक उदाहरण है।
<p class="Jove_content"> एक प्रमुख मुद्दा जब एससीआई के लिए एक पशु मॉडल की स्थापना के एक मानकीकृत चोट प्राप्त करने के लिए है। यह एक महत्वपूर्ण पहलू यह है कि कई एससीआई मॉडल में संबोधित किया गया है, जैसे, transection, hemisection, impactors, गुब्बारा संपीड़न, संदंश क्रश, स्थिर वजन संपीड़न, आदि उपकरणों को प्रभावित करने के लिए सम्मान के साथ, इस दिशा में प्रयास एससीआई मॉडल में में हुई है है वयस्क मूषक, जहां इस तरह की गति, बल और अवधि के रूप में प्रभाव के कई मानकों को चालाकी से किया जा सकता है (44 द्वारा समीक्षा)। एक और दृष्टिकोण, कम उपकरण शामिल है, केर-Lougheed धमनीविस्फार क्लिप 45,46 के एक संशोधन कार्यरत हैं। के रूप में impactor जबकि क्लिप mimics समवर्ती ischemia के कुछ डिग्री के साथ एक संपीड़न चोट एक contusion चोट mimics इन 2 दृष्टिकोण के पूरक हैं। क्योंकि पर्याप्त आकार की कमी और नवजात चूहों का अधिक से अधिक असुरक्षा की, उच्च मृत्यु दर अब सर्जरी के रूप में अच्छी तरह से विकसित करने की लागत के साथ जुड़ेछोटे पैमाने पर उपकरणों oping, यह एक impactor जनित नील दृष्टिकोण के बजाय एक क्लिप जनित संपीड़न विकसित करने के लिए चुना गया था। यह एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध धमनीविस्फार मिनी क्लिप आदत डाल नवजात चूहों 1 की कशेरुका स्तंभ के आकार को समायोजित करने के द्वारा पूरा किया गया। एक डाट जोड़ना एक मानकीकृत संपीड़न चौड़ाई सुनिश्चित करता है, और जब तक क्लिप के तनाव डाट की सीमा को compresses के रूप में, कम से कम चौड़ाई में स्थिर चरण के दौरान संपीड़न के बल थोड़ा भिन्न चाहिए। क्या मानकीकृत नहीं है, इसके गतिशील चरण के दौरान संपीड़न के वेग है, क्योंकि यह अपने जीवनकाल में क्लिप तनाव परिवर्तन के रूप में अलग अलग होंगे। संपीड़न के स्थिर चरण गतिशील चरण की तुलना में बहुत लंबे समय तक रहता है, और सुझाव है कि रीढ़ की हड्डी के ऊतकों मिनी क्लिप ब्लेड के खिलाफ एक जवाबी के ज्यादा डालती कम है के रूप में, यह संभावना है कि चोट की गंभीरता पर सबसे अधिक निर्भर है स्थिर चरण। यह, हालांकि, परीक्षण किया जाना बना रहता है। चोटगंभीरता को स्थिर संपीड़न बल और अवधि, संपीड़न और decompression के वेग, मिनी क्लिप की स्थिति, और एक ही स्थल पर प्रदर्शन किया compressions की संख्या सहित कई कारकों पर निर्भर होने की संभावना है। इस प्रकार, इन मानकों में मिश्रित भिन्नता कमजोर से गंभीर चोट कठोर अनुशासन की एक स्पेक्ट्रम की पीढ़ी में परिणाम सकता है। परिवर्तनशीलता के लिए क्षमता के बावजूद, हमारे पहले प्रकाशित एक अध्ययन में 1 हम ऊतकीय, शारीरिक और व्यवहार के स्तर पर अनुरूप परिणाम प्राप्त है, इसलिए वहाँ थोड़ा सुझाव है कि स्वीकार्य मानकीकरण प्राप्त करने के लिए मुश्किल है। हम ध्यान दें कि कि अध्ययन में हम हर स्तर पर मान्यता के कई तरीकों का इस्तेमाल किया, के रूप में चित्रा 5 में दिखाया गया है जैसे हवा-कदम के रूप में व्यवहार परीक्षण भी शामिल है।इस नवजात एससीआई मॉडल में चोट एक्सोन का एक निश्चित अनुपात की जरूरत नहीं पड़ती है और इस तरह फिर से modelin के माध्यम से अनुकूली प्लास्टिसिटी जानने के लिए अनुकूल स्थिति प्रदान करता हैबख्शा कनेक्शनों की जी और नए सर्किट के गठन। इसके अलावा, के बाद से नवजात माउस अच्छी तरह से कई प्रयोगात्मक विधियों द्वारा जांच के लिए अनुकूल है, यह संभव कार्यात्मक वसूली और एक एकीकृत दृष्टिकोण के साथ अनुकूली प्लास्टिसिटी, व्यवहार परीक्षण, प्रतिगामी और अग्रगामी axonal ट्रेसिंग, immunohistochemistry, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी और उच्च सहित अध्ययन करने के लिए इस मॉडल का उपयोग करने के लिए है -throughput ऑप्टिकल रिकॉर्डिंग 1। एक उदाहरण के रूप में, हम ब्रेन स्टेम के पूर्व vivo wholemount तैयारियाँ और घायल रीढ़ की हड्डी 1 में उच्च throughput कैल्शियम इमेजिंग का उपयोग विशिष्ट उतरते आदानों के स्तर पर नेटवर्क फिर मॉडलिंग प्रदर्शित करने के लिए इस एकीकृत दृष्टिकोण का फायदा उठाया। इस न्यूरो optogenetic और optogenetic औषध विज्ञान उपकरण का उपयोग कर रीढ़ की हड्डी में न्यूरॉन्स की विशिष्ट उप-जनसंख्या के बीच synaptic कनेक्शन के पुनर्गठन का आकलन करने से आगे धकेल दिया जा सकता है।
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work has been supported by grants from the South-Eastern Norway Regional Health Authority (JLB, 2014119; JCG, project numbers 2015045 and 2012065), by the Norwegian Research Council (JCG, project number 23 00 00) and the University of Oslo.
Materials
| Plastic seringe (30 or 50 mL) | |||
| Plastic petri dish (150x25mm) | |||
| Fortec isoflurane vaporizer | Cyprane | We use and old device out of production, check the link for newer device | |
| Yasargil temporary aneurysm mini-clip | Æsculap | FE681K | |
| Fine -Bore Polyethylene tubing ID 0.58mm, OD 0.96mm | Smiths Medical | 800/100/200 | |
| Isoflurane (Forene) | Abbott GmbH & Co. KG | ||
| Marcain (Bupivacain) | AstraZeneca | ||
| Insuline seringe 0.3ml 30Gx8mm | VWR | 80086-442 | |
| Ultra Fine Micro Knife 5mm cutting edge | Fine Science Tools | 10315-12 | |
| Extra Fine Graefe Forceps – 0.5mm Tip | Fine Science Tools | 1153-10 | Not really necessary, often the teeth are too large |
| Forceps SuperGrip Straight | Fine Science Tools | 00632-11 | Two forceps are necessary |
| Spongostan Special 70 x 50 x 1 mm | Ferrosan | ||
| Vannas Spring Scissors – 2mm Blades Straight | Fine Science Tools | 15000-03 | |
| Vario Clip Applying Forceps | Aesculap | FE502T | |
| Vicryl 6–0 (Ethicon) | Johnson and Johnson | J105G | |
| Diethrich micro needle holder | 11-510-20 | ||
| Temgesic (buprenorphine) | Schering-Plough | ||
| Stesolid (diazepam) | Actavis | Also known as Valium | |
| Pedamix | Fresenius Kabi | ||
| Klorhexidinsprit (chlorhexidine gluconate) | Fresenius Kabi | D08A C02 |
Riferimenti
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