Qui, presentiamo il protocollo di neovascolarizzazione coroideale indotta da laser (CNV) di topo, un modello sperimentale che ricrea i segni distintivi vascolari della degenerazione maculare neovascolare legata all'età (AMD). Una volta padroneggiato, può indurre in modo affidabile ed efficace la CNV come sistema modello per testare varie misure sperimentali.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Un modello di topo per Laser-indotta della coroide neovascolarizzazione
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il modello di neovascolarizzazione coroideale (CNV) indotta da laser nel topo è stato un modello fondamentale cruciale per la ricerca sulla degenerazione maculare senile (AMD) neovascolare. Somministrando lesioni laser mirate all'RPE e alla membrana di Bruch, la procedura induce l'angiogenesi, modellando la patologia distintiva osservata nell'AMD neovascolare.
Sviluppato per la prima volta in primati non umani, il modello CNV indotto dal laser è stato implementato in molte altre specie, la più recente delle quali è il topo. Gli esperimenti sui topi sono vantaggiosamente più convenienti, gli esperimenti possono essere eseguiti in tempi molto più rapidi e consentono l'uso di vari modelli transgenici. Le dimensioni in miniatura dell'occhio del topo, tuttavia, rappresentano una sfida particolare durante l'esecuzione della procedura. La manipolazione dell'occhio per visualizzare la retina richiede la pratica di abilità di destrezza fine e la coordinazione simultanea mano-occhio-piede per azionare il laser. Tuttavia, una volta padroneggiato, il modello può essere applicato per studiare molti aspetti dell'AMD neovascolare, come i meccanismi molecolari, l'effetto delle manipolazioni genetiche e gli effetti del trattamento farmacologico.
Il modello CNV indotto dal laser, sebbene utile, non è un modello perfetto della malattia. L'occhio del topo wild-type è altrimenti sano e l'ambiente corio-retinico non imita i cambiamenti patologici nell'AMD umana. Inoltre, l'angiogenesi indotta da lesioni non riflette gli stessi percorsi dell'angiogenesi che si verifica in uno stato di malattia cronica e legata all'età come nell'AMD.
Nonostante i suoi difetti, il modello CNV indotto dal laser è uno dei migliori metodi attualmente disponibili per studiare la patologia debilitante dell'AMD neovascolare. La sua implementazione ha portato a una comprensione più profonda della patogenesi dell'AMD, oltre a contribuire allo sviluppo di molte delle terapie AMD attualmente disponibili.
Introduzione
Età degenerazione maculare (AMD) è una delle principali cause di cecità negli individui di età superiore ai 50 1-3. AMD possono essere classificati in due forme: atrofica ("a secco") e AMD neovascolare ("wet") di AMD. La prima è caratterizzata da atrofia geografica dell'epitelio pigmentato retinico (RPE), coriocapillare e fotorecettori, mentre il secondo è caratterizzato dalla invasione dei vasi anomali della coroide negli strati retinici esterni causando perdite, emorragia, e la fibrosi, e in ultima analisi, porta alla cecità 1,2. Delle due forme, AMD neovascolare rappresenta la maggior parte della perdita della vista 1. Fortunat....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
Tutti gli animali sono trattati in conformità con la guida della cura e l'uso di animali da laboratorio 2013 Edition, l'Associazione per la Ricerca e la Visione e Ophthalmology (ARVO) Dichiarazione per l'uso di animali in Oftalmica e Vision Research, e approvato dal Animal Istituzionale Cura e Comitato Usa per la Northwestern University.
Nota: La seguente procedura può essere eseguita interamente con un operatore; tuttavia, è molto più efficiente condotto con due operatori ai compiti divisi conseguenza.
1. Preparare stazione laser e pre-laser
- Posizionare il laser e lampada a fessura dove....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Quantificazione del CNV può essere effettuata attraverso l'analisi dei coroide piatto montato con immunofluorescenza per etichettare i vasi CNV. I due metodi più frequentemente utilizzati di preparazione dei tessuti sono etichettatura FITC-destrano, fatto tramite perfusione immediatamente prima del sacrificio degli animali, o post mortem immuno-colorazione con un marker delle cellule endoteliali. Entrambi questi metodi sono stati descritti in precedenza in dettaglio 13,14,21; figure
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Ci sono diversi fattori che possono influenzare la consegna del laser e conseguente sviluppo CNV dopo il successo del laser-induzione. Questi fattori devono essere controllati e standardizzati per avere i risultati più affidabili. Il più pertinente di questi fattori sono la selezione del mouse (genotipo, età e sesso), la selezione anestetico, e le impostazioni di laser.
Il modello di topo specifico utilizzato può avere un effetto significativo sul corso dello sviluppo CNV. Il genotipo più ut.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano Jonathan Chou, MD per la sua assistenza nella preparazione e nell'editing del manoscritto finale e Wenzhong Liu per i dati OCT. Vorremmo anche riconoscere il sostegno della Macula Society Research Grant (AAF), il sostegno di una sovvenzione illimitata alla Northwestern University da parte di Research to Prevent Blindness, Inc., New York, NY, USA, e il sostegno di NIH-EY019951.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 532 nm (verde) laser oftalmico ad argon | IRIDEX | GLx | qualsiasi laser oftalmico ad argon a 532 nm (verde) può essere utilizzato |
| lampada a fessura | Carl Zeiss | 30SL-M | qualsiasi lampada a fessura può essere utilizzata purché compatibile con il laser |
| tribromoetanolo | Sigma | T48402-25G | utilizzato per fare l'anestetico |
| alcool terz-amilico | Sigma | 152463-1L | usato per fare l'anestetico |
| fiale di vetro ambrato + setti | Wheaton | WH-223696 | di stoccaggio al tribromoetanolo |
| VWR | 82003-820 | varie | |
| 1% Tropicamide | Falcon Pharmaceuticals | RXD2974251 | dilatazione pupillare |
| 0,5% Tetracaina cloridrato | Alcon | 0065-0741-12 | per anestesia topica |
| Alcon | 58768-788-25 | di idratazione | |
| (per il riscaldamento degli animali) | Kent Scientific | HTP-1500 | utilizzato per mantenere il cuscinetto riscaldante della temperatura del corpo animale |
| Kent Scientific | TPZ-0510EA | mantiene la temperatura corporea animale | |
| 30 G aghi per insulina | BD | 328418 | iniezione per anestesia |
| Bilancia americana | AWS-1KG-BLK | Pesatura del mouse | |
| vetrino coprioggetto (25 mm x 25 mm) | VWR | 48366089 | appiattire la cornea per visualizzare la xilazina della retina del topo |
| ottenuta dall'istituto | anestesia dell'istituto | ||
| ketamina | ottenuta dall'istituto | anestesia | |
| Volocity | PerkinElmer | utilizzato per la ricostruzione volumetrica | |
| ImageJ | National Institutes of Health | utilizzato per l'analisi delle immagini |
Riferimenti
- Bressler, N. M., Bressler, S. B., Fine, S. L. Age related macular degeneration. Surv Ophthalmol. 32, 375-413 (1988).
- Congdon, N., et al. Causes and Prevalence of Visual Impairment Among Adults in the United States. Arch Ophthalmol. 122, 477-485 (2004).
- Ja....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
Esplora altri articoli
Modello murino di AMDepitelio pigmentato retinicolesione della membrana di Bruchanalisi mediante microscopia confocaletomografia a coerenza otticamarcatura con destrano fluorescentecolorazione per i marker delle cellule endotelialiquantificazione della coroide in flat mountprocedura laser con lampada a fessura
