SPRi、ナノのSPRiおよびELISAアッセイを用いて血清中のヒト成長ホルモンの比較分析

Summary

提案された作業は、市販の酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）を用いて直接のSPRi結果を比較することにより、特にスパイクヒト血清中の組換えヒト成長ホルモンの検出のために、直接、増幅、表面プラズモン共鳴イメージング（のSPRi）アッセイの診断の可能性を評価しますキット。

Abstract

広範囲の濃度にわたって、ヒト成長ホルモン（hGH）を検出するための高感度かつ選択的な方法（50-100 ngのmlの高レベル^– 0.03 ngのmlの¹及び最小レベルが^{– 1）}循環血液中の変数のレベルとして不可欠であるかもしれません変更された生理機能を示します。例えば、子供の頃に発生する増殖性疾患は、血液中のhGHのレベルを測定することによって診断することができます。また、スポーツにおける組換えhGHの悪用だけではなく、それはまた、虐待者への深刻な健康への脅威を提示し、倫理的な問題が生じます。非22 kDaの内因性レベルは、外因性の組換えのhGH（rhGHの）投与後にドロップとしてのhGH誤用を測定するための1つの一般的な戦略は、合計のhGHへの22kDaのhGHの比の検出に依存しています。 表面プラズモン共鳴画像（のSPRi）屈折INDの変化を記録することによって、生体分子の相互作用の直接的な（ラベルフリー）モニタリングと可視化を可能にする分析ツールです。リアルタイムでセンサー表面に隣接する元。対照的に、最も頻繁に使用される比色法、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）は、間接的に色の変化を誘発する基質を加えた後に検体濃度を測定するために酵素標識した検出抗体を使用します。検出感度を高めるために、増幅のSPRiは、信号強度を増大させるために、サンドイッチアッセイフォーマットおよび近赤外量子ドット（QD）を使用します。スパイクされたヒト血清中の組換えのrhGHの直接のSPRi検出した後、のSPRi信号が近赤外量子ドット（ナノのSPRi）でコーティングされた検出抗体の連続注入によって増幅されます。本研究では、直接、増幅のSPRiの診断可能性は、ヒト血清中にスパイクし、市販のELISAキットの能力と直接比較したrhGHを測定するために評価しました。

Introduction

ヒト成長ホルモン（hGH）は191アミノ酸のペプチド（22キロダルトン）、下垂体によって産生され、直接血流に放出されます。視床下部ペプチド成長ホルモン放出ホルモン（GHRH）および成長ホルモン間の相互作用は、hGHの拍動性分泌を誘導します。その結果、hGHのレベルは0.03 ngの/ mlの範囲¹で安値に50〜100 ng / mlで高値で異なります。体内の欠乏またはhGHの過剰は、異常な生理学的症状の広い範囲を引き起こすことができます。例えば、hGHの過剰レベルは巨人症²型糖尿病および³につながることができます。 hGHの枯渇レベルは新生児に低血糖を引き起こす、と大人⁴に弱い骨密度とうつ病。

体脂肪を減らしながらのhGH（rhGHの）の組換え型の投与は、除脂肪体重を向上させます。それはADVを与える物理的強度を向上させるなどのように、この物質は、プロとアマチュアスポーツ選手のための第一選択薬となりました競技スポーツでアンテージ。 rhGHは、その存在または同化作用を検出することができるテストを開発する上で注目されている国際的な研究者が世界アンチ・ドーピング機構^{（WADA）5,6}及び多くの努力により禁止されています。

酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）は、全血⁷におけるhGHの決意するための好ましい方法でした。 ELISAは良好な感度と選択性を提供する信頼性の高い技術であるが、比較的時間と労働集約的です。また、ELISAは、酵素タグを使用することによって、hGHの間接的検出に依存します。対照的に、表面プラズモン共鳴（SPR）は、リアルタイムでのラベルを使用することなく、直接、hGHの検出を可能にします。 SPR後ろ検出原理は、薄い金属層（金または銀）で被覆されたプリズムからなるセンサ面を伴います。単色の偏光が金属表面と相互作用する場合、「表面プラズモン」が生成されます。検体の結合金属表面上に固定化された表面受容体へのその後の分析対象物濃度と相関させることができるシフト共振ディップが生じる共振状態を乱します。 SPRベースのバイオセンサーは、生体分子結合事象および生化学反応^{8-10を監視する}リアルタイム、ラベルフリーの技術を提供している現在市販されています。最近では、のSPRiは多重化の必要性に応じて開発された（ すなわち、同時に複数の結合事象のモニタリング）古典SPRバイオセンサでは不可能でした、。したがって、のSPRiは同時に複数の結合事象を監視するためのツールと​​して浮上しています。現在のSPRiシステムは、特定の角度と波長¹⁰の光で励起された表面の顕微鏡イメージングに基づいています。画像は、電荷結合素子（CCD）アレイ上に捕捉されます。

今日まで、hGHの^{11-14を検出するために開発され} 、いくつかのSPRベースのアッセイが行われています。一つの特定の戦略非22-kDaの内因性レベルは、外因性のrhGHの投与後にドロップとして、アイソフォーム法¹⁵として知られ、合計のhGHへの22kDaのhGHの比の検出に依存しています。最近では、フアン・フランコら ^11は 22 kDaのヒト血清サンプル中の20kDaのhGHアイソフォームの選択的検出のためのSPRベースの免疫の開発を報告したデ。各アイソフォームに特異的なモノクローナル抗体は、0.9 ngのミリリットル^-1で検出限界を持つ単一の注射で同時に両方のアイソフォームの測定を可能にする金センサ上に直接固定化しました。代替的に、SPRは、hGH ¹³に対して高い特異性を有する抗体をスクリーニングするために使用されてきました。標的分析物の濃度は検出のSPRiシステムの限界（<nM）を下回った場合は、1は、ナノ粒子（ナノのSPRi）の利用を経由してのSPRi信号を増幅に頼らなければなりません。このようなSPRベースの増幅はよくVについての文献^16-19に記載されています検体および表面のarious種類。

本研究では、のSPRiとナノのSPRiベースのバイオセンサーの分析の可能性は、特にスパイクヒト血清中のrhGHの検出、および直接ELISA法との検出能力の比較のために、検査しました。以下のパラメータを見直し、検討されます。検出時間、感度、動態プロファイル、再現性と特異性。

Protocol

SPRiのためのソリューションおよびタンパク質試料の調製 10mMリン酸塩、150mM塩化ナトリウム、およびpH 7.4を含有する低塩リン酸緩衝生理食塩水（PBS）溶液100mlを準備します。 10mMリン酸塩、750mMの塩化ナトリウム、およびpH 7.4を含む高塩PBS溶液50mlを調製します。 10 mM酢酸ナトリウムの5ミリリットルを準備します。 低塩溶液をPBSで希釈した5 mg / mlのウシ血清アルブミン（BSA）のストックを調製。 低塩PBS溶液中に1μg/ mlの濃度で組換えヒト成長ホルモン（rhGH）のストック溶液を調製します。 100μg/ mlの濃度で抗のrhGHおよび陰性対照抗体のストック溶液を準備します。 2.抗体アレイ用のSPRiチップを準備 50℃で90分間（1 30％過酸化水素に濃硫酸3）とすすぐことによって安定化されたフォローピラニア溶液120mlに超音波処理することにより、チップを清掃5分間水で超音波処理。その後、窒素流でエタノールとドライでチップをすすぎます。 任意の汚染物質を除去するために30分間UV /オゾンチャンバー内の金のチップを置きます。 攪拌棒及び管のキャップが含まれている試験管に20ミリリットルのエタノールに11メルカプトウンデカン酸150mgのを追加します。 50 Wで試験管およびマイクロ波チューブ/チップにチップを置き、5分間50℃。 エタノールでチップを洗浄し、5分間エタノールに浸します。 水ですすぎによってに従い、5分間水に浸します。 攪拌棒及び管のキャップを含んでいる試験管内の20mlの水に1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド150mgのを加えます。ステップ2.4​​のように、マイクロ波チップ。 水でチップを洗浄し、5分間水に浸します。 攪拌棒及び管のキャップを含んでいる試験管に20mlの水にN-ヒドロキシスクシンイミド150mgのを加えます。ステップ2.4​​のように、マイクロ波チップ。 水でチップを洗浄し、5分間水に浸します。 Prepa攪拌棒及び管のキャップが含まれている試験管内の20mlの水で250μMのポリエチレングリコール（PEG、800 Da）で再。ステップ2.4​​のように、マイクロ波チップ。 注：センサーの表面上のマイクロ波PEG800は、後の実験で使用される血清タンパク質と量子ドット複合体の非特異的結合を防止するためのブロッキング工程として実行されます。これは、PEG800は、チップ上の非占有裸の金部位と反応させることにより達成されます。 水でチップを洗浄し、5分間水に浸します。 抗rhGHの抗体溶液と抗免疫グロブリンG（抗IgG）のネガティブコントロール液15μg/ mlを調製し、384ウェルプレート中のウェルに各抗体溶液10μlを加えます。 500μmのテフロンを使用して、抗体を用いてマイクロアレイヤー（各サンプルの4×7の象限）とスポットチップでスポッティングパターンを設計するには、ピンをひっくり返し。 RTで75％以上の湿潤雰囲気下で2時間斑点チップをインキュベートします。 すすぎ、水にチップを浸し5分。その後、窒素流で乾燥したチップ。 3.のSPRi実験のセットアップとブロッキング楽器を選択し、ディレクトリを初期化します。リアルタイムのカメラを選択し、脱気した水10mlで1 ml /分でシリンジポンプを起動します。機器にチップを挿入して、すべての気泡が除去されるまで水を注入しておきます。 10mlの水でチップを洗浄した後、画像取得を開始し、低塩、PBSにバッファーを切り替えて従うと、それは5ミリリットルのために1ml /分で実行できるようにし、20分間ダウンを20μl/分、その後遅い流速。 チップ上にスポット固定化された抗体を示し、高対比画像を選択します。 固定された抗体に対応する400μmの個々の円形のスポットを選択して定義します。 機器がプラズモン曲線をトレースした後、反射率曲線における最大の傾斜を有する作動角を選択します。 低Sの20μL/分でランニングバッファーフロー選択されたスポットのすべてからの信号が安定するまでのシステムを介して、PBSをALT。 負荷位置に噴射弁をサンプルループ（150μL）にバッファを実行するには、BSA（100μg/ ml）をロードします。その後、フローセルに溶液を注入する注入位置にバルブを切り換えます。 注：BSAは共有結合、アミン反応性表面に結合するように注入され、残りの未結合BSAは、バッファリンスを介して表面を洗い流します。 表面上の10 mM酢酸ナトリウムの溶液を150μLを注入し、高濃度の塩のPBSを150μl注入することにより行います。 アミン反応性表面を不活性化するためにエタノールアミン（1ミリモル）の150μLを注入します。 表面を洗浄するために10 mM酢酸ナトリウムの150μLを注入します。 その後、5ミリリットルの合計250マイクロリットル/分の流量で50μg/ mlのBSAを含むPBSにランニングバッファーを切り替えます。 注意：50μg/ mlのBSAはシュールの追加のブロッキングのためのランニングバッファーに追加されます非共有結合の非特異的部位を占有し、これはさらに、表面に非特異的血清タンパク質の結合を減少させるために行われることにより、顔。 5μL/分に変更し、流量を、それが20分間安定させます。 ヒト成長ホルモンの4のSPRi検出 10％血清及び1mg / mlのBSAを含有するPBS中に希釈したrhGHの設定濃度（2.5 pg / mlで、および0.25 pg / mlで、250 pg / mlで; 25 pg / mlで3万pg / mlで）の溶液を調製します。 0.5ミリリットルマイクロチューブに赤外線量子ドット（1μM）の近くにコーティングされたストレプトアビジンの3μlにビオチン標識抗rhGHを検出抗体（6μM）の1μLを追加することにより、1液と有効な結合のために30分間インキュベート：2を準備します。 注入ループでヒト血清溶液をスパイクしたhGHの150μLを注入します。これは、表面からすすぎ非特異的に結合した血清からゆっくり降下が続くシグナルの強い増加をもたらします。 記号たらアルは、ランニング緩衝液に添加450 mM塩化ナトリウムの溶液で表面を洗浄し、安定化します。 10 nMの（2：1）の濃度に対する抗rhGHを検出抗体と量子ドットの溶液を希釈緩衝液を実行している（PBS、50μg/ mlのBSAを含む）及びフローセルに注入します。 5.のSPRiデータ分析注：のrhGHの注射後は、ヒト血清および量子ドットエンハンサーをスパイク、反射率変化の増加は、プラズモン曲線の増幅されたシフトに起因する発生します。これは、チップ上の信号に相関するグレースケール画像を表す差分画像が得られます。 データ解析プログラムにデータをインポートします。時間（s）対のSPRi信号（％の反射率）をプロットし、高塩洗浄後の抗rhGHを、負の対照抗体のスポット間の差を求めます。 6. ELISAプロトコル（1日目） すべてのアッセイ成分は、私を含め保管nは2〜8℃でのrhGH ELISAキット。これは、ヒツジ血清、ヒト血清中のコントロール（1＆2）、共役バッファ、（200X）洗浄緩衝液、クロモゲンTMB（テトラメチルベンジジン）でウェルプレート、標準（0-5）を塗布し、試薬を止める抗rhGHの抗体が含まれます。 セットアップ試薬および市販のELISAキットのプロトコールに記載の方法に従ってください。 まず、抗rhGHの抗体は、従来の箔パッケージを開封し、室温に加温し96ウェルをコーティングしたことができます。 その後、アッセイのために8ウェルストリップの所望の数を削除し、2〜8℃で残りのウェルと店舗を含む箔パッケージを再シール。 標準の蒸留水（1-5）1ml中、およびコントロールの蒸留水1ml（1＆2）で、標準の＃0のために2mlの蒸留水で再構成することによって基準を準備します。以下は、標準およびコントロール（ 表1）の対応する濃度のテーブルには、次のとおりです。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep–next.withinページ= "常に"> スタンダード 濃度（ngの/ ml）を 0 0 1 0.17 2 0.94 3 2.63 4 10.4 5 26.9 対照＃1 1.22±0.33 ng / mlでコントロール＃2 4.97±1.25 ng / mlで 表の基準とコントロールの1濃度は、市販のELISAキットに含まれています。 以下の濃度（ 表2）で、10％ヒト血清中のrhGHホルモンで構成されたサンプルを準備します。 <強い>サンプル 濃度（ngの/ ml）を 1 0.025 2 0.2 3 0.5 4 2.5 5 10 6 30 表10％血清中で調製したrhGHサンプルを2濃度。 （三重で）を各ウェルに各標準、対照およびサンプルの50μlのを追加します。井戸を密封し、穏やかに振盪下に4℃での標準、コントロール、およびrhGHのサンプルO / Nでインキュベートします。 7. ELISAプロトコル（2日目） シェーカーからプレートを取り外し、それはアッセイの前に進むにRT（15〜20分）に加温することができます。 削除アンチのrhGH-HRPコンジュゲートバ​​ッファー、洗浄バッファー（200X）、色素原TMB（テトラメチルベンジジン）、冷蔵庫からD停止試薬とを室温に温めことができます。 試薬の調製：（製造元の仕様に応じて） 共役緩衝液でアンチのrhGH-HRP 40倍希釈します。蒸留水で200倍に希釈して洗浄バッファーを準備します。 、各ウェルにアンチのrhGH-HRPコンジュゲートの50μlを添加したウェルを密閉し、穏やかに振盪しながら室温で30分間インキュベートします。 井戸からの溶液をデカントし、プレートを反転し、吸収性組織上にドライタップします。その後、各ウェルに洗浄用緩衝液200μlを添加します。 洗浄溶液をデカントし、吸水性組織上にドライタップします。このステップを3回繰り返します。 洗浄ステップの後、15分以内に各ウェルにTMB基質100μlのを追加します。静かに振盪しながら暗所で室温で30分間インキュベートします。ソリューションは、無色から青に変わります。 各ウェルに停止試薬を100μlを追加します。ソリューションは、青から黄色に変わります。すぐに、目を読みますマイクロプレートリーダーを用いて450nmで各ウェルの吸光度E。 提供規格（0-5）のための標準曲線をプロットします。その後、各サンプルの濃度に対して10％の血清サンプル中のrhGHの光学密度をプロットします。

Representative Results

SPRiとナノのSPRi（NanoEnhancersを採用するのSPRi）の性能は、複雑な環境でのrhGHの検出のためのELISA法と比較しました。これらの方法の設定の違いは、ここで簡単に説明します。 SPRi（直接検出、 図1）については、捕捉抗体は、表面上に固定化され、次いでサンプルを注入し、センサー表面への検体の結合のリアルタイムおよびラベルフリーの方法で直接測定されます。分析物がセンサー表面に結合した後、しかし、ナノのSPRi（ 図1）を用いて、連続した噴射がのSPRi信号を増幅するために、検出抗体で被覆された量子ドットと続きます。 図1のCでのrhGHの検出のダイレクトモード（のSPRi）を比較略図及び増幅モード（ナノのSPRi）失礼なサンプル。リガンド（rhGHをまたはIgG特異的抗体）がのSPRiのバイオチップ上のアレイ形式で固定化しました。標的タンパク質（rhGHの）はセンサ表面に導入されたヒト血清中にスパイク直接（のSPRi）を検出し、順次NanoEnhancers（ナノのSPRi）と強調した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 ELISAに関しては、マルチウェルプレートは、既に捕捉抗体で予め官能到着すると、サンプルを導入し、目的の分析物が結合します。検出抗体は、基質を加え、続いて導入されます。光学密度は、その後、450nmで測定されます。本研究では、市販のELISAキット（図2）のrhGHを10％ヒト血清にスパイクを測定するために使用しました。 8 / 53508fig2.jpg "/> 図2 ELISAアッセイ手順の略図 。 rhGHタンパク質（青楕円）のrhGHのに特異的なモノクローナル抗体（黄）で予め官能化されているウェルに導入されます。非特異的相互作用は、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP、紫）でprefunctionalized検出抗体を導入し、続いて洗浄緩衝液でウェルを洗浄することによって除去されます。解決策は、基質テトラメチルベンジジン（TMB、金）を追加した後の色に変化します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 図3は、のrhGHの滴定曲線は、10％ヒト血清にスパイクし、450 nmで得たODに対してプロットされている表します。良好な線形応答が観察され、検出限界は、1 ngの/ mlであると決定されました。 VARの係数iation（CV）は、良好な再現性を示唆して6.5％でした。 図3. ELISAデータ分析。血清中にスパイクのrhGHの濃度は、450nmで得られたODに対してプロットされている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 次に、ヒト血清中にスパイクしたrhGHの検出のSPRiで評価しました。 rhGHの直接検出は、対応する濃度勾配曲線（ 図4）で得られた、各点は、各濃度について3のSPRi動態曲線から計算した反射率差の平均値を表します。検出限界（LOD）は、3.61 ng / mlであると決定されました。 SPRi直接検出アッセイは、アッセイのCVとして非常に再現性がありました唯一の4.1％でした。 hGHの図4.直接のSPRi検出を、10％ヒト血清中にスパイクした。hGHの様々な量を注入した後、得られた正規化のSPRi運動プロットが高塩緩衝液の注入（垂直破線）は、非除去するための、ヒトの血清中にスパイク固有の相互作用。 hGHの様々な量の結合を表す濃度勾配曲線は、ビオチン化hGHの固有-抗体でprefunctionalizedされたセンサ表面にヒト血清にスパイクした。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 SPRiバイオセンサの感度を高めるために、NanoEnhancersは（量子ドットは、検出抗体で予備官能化）に順次ヒト血清中スパイクのrhGHの存在を強調するためにセンサ表面にtroduced。 。の関心イメージングの制御された領域上に図5、バックグラウンド減算した後、NanoEnhancersは、最小限の信号変化（免疫グロブリンG（IgG）特異的抗体、反射率0.38％の変化で、しかし、7.9％までのバイオセンサーの応答を増幅することができましたセンサー表面は、rhGHの特異的抗体を持っている興味のある領域のみが経験に運動センサーの応答を直接裏付ける最大のコントラスト変化を固定化したことを明らかにしました。 図5.事前にサンドイッチアッセイを10％ヒト血清にスパイクした。のSPRi動態プロットバッファー中のrhGH（30 ngの/ ml）を注射した後（10mMのPBS、150mM塩化ナトリウム、pH値= 7.4）を用いたrhGHの検出 11メルカプトウンデカン酸/ rhGH-と-functionalizedチップ特異的抗体、その後、検出抗体でコーティングされた量子ドット（NanoEnhancers）を加え、続いて、BSAでブロックしたIgG抗体を制御する。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 ナノのSPRiバイオセンサーの実用性を実証するために、粗製サンプル中のrhGHの測定範囲を評価しました。 0.25 PG / mlの3万PG /から拡張作業範囲はNanoEnhancers（ 図6）の添加に応答として得られました。これは、滴定曲線上の各点は、3つの独立した実験から平均化されることは注目に値します。したがって、検出の下限は9.20 pg / mlであることが算出され、変動係数は20％でした。 図6。hGHのナノのSPRiの検出は、ヒト血清中にスパイクされたヒト血清サンプルについてhGH_specific_Anti、量子ドット、増幅された信号の正規化のSPRi動態プロット表現はhGHの異なる濃度でスパイクしました。 （灰色の）垂直の破線は、ランニング緩衝液の注入点を表します。 （b）は、hGHの様々な量の注入後NanoEnhancers（hGH_specific_Anti、量子ドット）の結合を示す濃度勾配曲線11メルカプトウンデカン酸/ hGHを特異的抗体でprefunctionalizedされたセンサー表面にヒト血清にスパイクした。 クリックしてくださいここで、この図の拡大版を表示します。 次に、濃度の関数としてのSPR反射率曲線で発生する変更は、直接およびNanoEnhancerバイオアッセイ法（ 図7）との間で比較しました。直接デについて25および0.25 pg / mlでの間tection技法は、信号が平坦域に開始し、これらの濃度が3 ng / mlで（ 図7）のLODを下回るように、これは驚くべきことではありません。同様に、増幅された技術のために、9.2 pg / mlで信号のLOD以下の濃度は、高原に開始され、実質的に全く変化を示さありませんでした。 rhGHの導入は30,000ヒト血清中NanoEnhancersの注入に続いて（直接検出）（増幅された検出）をスパイクした後、 図7ナノのSPRiでのSPRiの比較分析。この棒グラフは、反射率の変化率（％R）を示しますpg / mlで、2.5 pg / mlで250 pg / mlで、25 pg / mlであり、0.25 pg / mlで。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = "1">さらに、ナノのSPRiバイオセンサの特異性を評価しました。インスリン様成長因子-1（IGF-1）は、hGHが肝細胞膜上の成長ホルモン受容体を介してIGF-1の分泌を刺激するための対照として注射したヒト血清にスパイク。 IGF-1血清中の注入後、NanoEnhancersを順次注入し、SPRシグナル応答は、任意の特異的結合（ 図8）を示さありませんでした。血清試料中のスパイクのrhGHのrhGHが抗体で官能全く同じ場所に注入されたときしかし、シグナル増強が観察されました。結論として、ナノのSPRiプラットフォームは、rhGHのための優れた特異性と選択性を示しました。 図8のrhGHに向けてナノのSPRi選択性の評価。s内のrhGH（黒）およびIGF-1（赤）の注射後のナノのSPRiバイオセンサーの応答先のとがった血清。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 相関分析のSPRiは、信号強度およびELISAの光学密度の値（ 図9）との間の相関を決定するために、ピアソンの相関係数を用いて行きました。 p値<0.01を有意とみなしました。このグラフに示されるように、のSPRiおよびELISAによって測定スパイクヒト血清中のrhGHレベルの間に良好な相関があります。 r値は、9種類の試料について0.9263でした。 ELISA及びナノのSPRi間に 図9 ピアソン相関分析。プロットは、ELISA光学濃度（x軸）の値を持つナノのSPRi信号強度（y軸）を相関させます。 （梨相関係数のn = 9、R = 0.9263、P = 0.00000183）に。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 平衡解離定数（K D）は、ELISA用のGraphPadソフトウェアを用いて決定しました。計算されたK D値は、約79 nMであった（表3）。 （Kのa）のオンとオフ（K d）は速度をELISAによって決定することができませんでした。しかし、データ分析ソフトウェアを使用して、直接検出方法は、1つのrhGH分子に相当する22キロダルトンの分子量を用いて、23ピコモルのK D値となりました。オンとオフ率は、それぞれ6.1×10 7 M -1 s -1の1.33×10 -3 秒 -1であると計算されました。これは本質的に変換し、第2あたりのrhGHおよび抗体複合体崩壊の0.13％。 AについてmplifiedのSPRi実験、より強力な全体的な相互作用を計算した結合親和性としてNanoEnhancersとのrhGHの間で観察されたが4.3 pMであると決定しました。また、強​​力な会合速度が捕捉抗体よりNanoEnhancersとのrhGHのために観察された/ rhGHを、しかし解離速度が示唆毎秒NanoEnhancer /のrhGH /捕捉抗体崩壊の0.26パーセント。 方法 K D（アフィニティ） K（オン率） （オフレート） の K d LOD ELISA 79.45×10 -9 M NA NA 1 ngの/ mlの SPRi 23.2×10 -12 M 6.1×10 7 M -1 秒 -1 <td> 1.33×10 -3 秒 -1 3.61 ng / mlでナノのSPRi 4.33×10 -12 M 7.54×10 8 M -1 秒 -1 2.62×10 -3 秒 -1 0.0092 ng / mlで 表3.全動態データ解析。親和性の評価、レートオンとオフ率グラフパッド（ELISA）およびデータ解析（のSPRiとナノのSPRi）ソフトウェアを用いて抗体応答の。 1のrhGH分子に対応する22キロダルトンの分子量を用いて、結合活性の決意を選択しました。検出限界は、Excelを使用して、すべての3つの研究のために決定しました。

Discussion

hGHの、天然に存在するホルモンの不規則なレベルは、人間の成長と発展に影響を与える多数の医学的障害にリンクされています。また、のrhGHの外因性投与は、一般的に、その性能を高めるために、ドーピング剤として、それが禁止されているにもかかわらず、運動選手によって使用されます。内因性のフォームから外因性のhGHを区別することの困難からのrhGHの誤用の結果を検出するのに挑戦。このように、外因性のhGHを検出するための現在認可された技術は、20 kDaのアイソフォームに関連して22 kDaのhGHのアイソフォームの割合を測定することに依存しています。広い濃度範囲で短時間で同時に複数のhGHアイソフォームを測定するためのアイソフォームのテスト要求するので、したがって、私たちは完全な一致としてのSPRiプラットフォームを検討しました。また、内因性のhGHレベルしたがって、検出システムは、高SPで快適にこの範囲を測定することができなければならない血流中（0.03 ngの/ ml）を非常に低いレベルに変動しますecificity。その結果、我々はまた、hGHのための診断ツールとして、本研究ではナノのSPRiの可能性を調査し、のSPRiと古典免疫測定法、ELISAと直接比較しました。

この研究から得られた結果に基づいて、のSPRi及びナノのSPRi方法の主な利点は、のrhGH濃度がより従来の方法のELISAに比べて迅速な方法で測定することができるということです。ナノのSPRiがプロセスに追加のステップのために2時間を要したのに対し、直接検出法と一つのサンプル中のrhGHレベルを測定するための標準的な持続時間は1時間でした。全体的に、のSPRiとナノのSPRi実験では、サンプルの注入前に、較正ステップを強くお勧めします。加えて、結果としていくつかの非特異​​的相互作用におけるヒト血清の結果のような粗試料の注入は、それは、特定の相互作用を明らかにするために、高塩洗浄緩衝液を注入するために不可欠です。これは、洗浄工程が絶対に必要であることも注目に値します非結合分子を除去するために、センサ表面に分子を遮断導入後。 ELISA時間要件に関しては1試料の分析のために（〜16〜18時間）、はるかに大きいです。アッセイの感度は、特にこの研究のために強化されるように、焦点検出の下限値を比較することであったように、より長いインキュベーション時間が必要です。

表面化学の選択は、あるアプリケーションから別のものに変化し、これは、のSPRi技術の限界の一つとして実現することができます。本研究では、広い範囲の化学的リンカーおよびブロッキング分子の組み合わせは、センサ表面へのrhGHの最適な結合効率を観察するために適切な組み合わせを達成するために評価しました。例えば、この研究において、BSAとPEGとの組み合わせは、非特異的相互作用を最小限にするに十分に役立ちました。しかし、捕獲リガンドは、アプタマーであった以前の研究^17には、PEGだけでは最高のブロッキング分子を務めました。変数それは、リガンドへの検体の結合効率に影響を与え、またpHは、緩衝液および温度に依存しています。したがって、任意のアプリケーションで、これらの変数を最適化する必要があります。また、チップ表面へのリガンドの最適なスポッティング濃度を決定することが重要です。固定化リガンドの濃度範囲での滴定実験は、研究を開始する前に実行されます。これは残留液体が残りません確保としてELISA用として、手順における重要なステップは、マイクロプレートを叩いてウェルから洗浄緩衝液をデカントすることでした。ピペットで緩衝液洗浄を削除すると、ターゲットサンプルの信号読み出しを妨害する任意の残液としては十分ではなかったです。

感度を参照して、ELISA（1 ng / ml）をのSPRi（3.61 ngの/ mlで）が、ナノのSPRi（9.20 pg / mlで）に匹敵する、それによってのrhGHの低い生物学的レベルでの測定を可能にする、3桁感度を向上させ0.03 ng / mlで。我々は以前に^1を報告したように6,17は、NanoEnhancersによって付与される信号強調は、質量負荷効果と近赤外蛍光団と金膜のナノ構造のための表面プラズモンを伝播する間に存在する強い結合に起因します。 、ナノのSPRiがプロシージャに余分なステップを追加していますが、この感度のレベルはさまざまな店舗でのSPRi技術の用途を広げることができます。

ELISAは唯一の親和性値を報告することができ、一方のSPRiは、科学者に抗体/ rhGHの相互作用の完全動態プロファイル_（K D、K _aおよびK _d）を提供します。変動係数（CV）は、良好な再現性を示唆している、のSPRi（4.1％）およびELISA（6.5％）が10％未満でした。センサーチップ上に固定化された捕捉抗体をELISA 96ウェルプレートに固定化された抗体とは異なるため、ELISAとのSPRi親和性の値が異なっています。ナノのSPRiとして高いCV値（20％）が観察されました。 ERROの源として貢献することができるいくつかのパラメータがあります。CVの決意のためのRS。例えば、分析物のかなり低い濃度が測定されているナノのSPRi実験で、NanoEnhancersの添加は、手順における別のステップを追加し、実験は、手動で行いました。ナノのSPRiおよびELISAの間に非常に良好な相関がスパイクヒト血清中のrhGHの検出を達成しました。最後に、ELISAは、方法自体は、それがhGHのの場合のように、それは難しい、リアルタイムの監視と多重化を必要とする状況で使用できるようになり、時間がかかりますが信頼性の高い技術であることができます。また、のSPRiをELISAを介して提供しています。この研究では、直接調査しなかったより魅力的な特徴は、同時にリアルタイムで相互作用の数百を測定する能力です。したがって、将来的に、ナノのSPRi方法は、実行可能な臨床診断ツールとしての可能性を検討するために、種々の濃度の血清中に存在する多数のバイオマーカーを同時にリアルタイムで（多重化）を検出するために評価されます。

Materials

Somatotropin Growth Hormone (GH1) capture antibody	Acris Antibodies	DM1015
Bovine Serum Albumin	Fisher Bioreagents	BP671-10
Biotin labeled Somatotropin Growth Hormone (GH1) detection antibody	Acris Antibodies	AM09304BT-N
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide	TCI America	D1601
Ethanolamine	Acros Organics	141-43-5
Ethanol	Fisher Chemicals	BP2818-4
Human HGH ELISA Kit	invitrogen	KAQ1081
Human Serum	Sigma Aldrich	H4522
Rabbit IgG Antibody	Sigma Aldrich	I5006
11-mercaptoundecanoic acid	Sigma Aldrich	450561
Nanostrip	Cyantek
N-hydroxysuccinimide	Sigma Aldrich	130672
Phosphate Buffer Saline	Invitrogen	00-3002
Polyethylene glycol (800 Da)	Sigma Aldrich	729108
Recombinant Human Growth Hormone	Calbiochem	869008
Sodium Acetate	Sigma Aldrich	127-09-3
Sodium Chloride	Fisher Chemicals	7647-14-5
Streptavidin coated near infrared quantum dots	Life Technologies	Q10171MP
UV/Ozone Procleaner	Bioforce Nanosciences
Microwave reactor	CEM Corporation		Discover system
SPRi-Arrayer	LabNext Xactll Microarray System
SPR biochip	HORIBA
SPRi-Lab+	HORIBA
Synergy Mx Multimode Microplate reader	BioTek
ScrubberGen	HORIBA		Data Analysis software