的策略，以验证胼胝质介导的Plasmodesmal浇注在热带反应中的作用
Summary
本文介绍了筛选基因控制的热带响应期间plasmodesmal渗透性，因此生长素梯度的方法。这包括在胚轴热带反应程度的测量 拟南芥和8羟基芘-1,3,6-三磺酸（HPTS）装载终于胼胝质水平评估检查plasmodesmal渗透性。
Abstract
植物激素生长素起着许多生长和发育过程，包括对光和重力热带反应中起重要作用。生长素梯度的建立是导致向光性和向地关键事件。先前，生长素极性运输（PAT）的结果表明在植物中的不同蜂窝结构域建立生长素梯度。然而，韩等人最近证明为正确生长素梯度的形成，在相邻小区之间plasmodesmal胼胝质介导的共质体连通也是一个关键的因素。在此手稿，策略阐明特定基因，其中可通过改变通过调制plasmodesmal胼胝质合成的共质体连通影响向光性和向地的作用，进行了讨论。第一步是筛选从突变体或基因的过表达的行3天龄的黄化苗异常嗜应答与野生型一起。这初步筛选可导致一系列基因PAT功能或控制共质体连通的识别。第二次筛选涉及候选人，显示通过影响共质体连通改变热带响应的排序。为了解决这样的候选人，一个共质体示踪剂的运动和plasmodesmal胼胝质的沉积进行检测。探索新的候选基因可以在热带的反应和其他发育过程直接或间接调节共质体连通这一战略将是有益的。
Introduction
植物，如固着活的生物体，已经开发了细胞 – 细胞信号传导的高度复杂的网络，以解决各种环境刺激。热带反应是由植物对环境刺激作出反应的现象之一。植物显示出两个主要的热带响应，向光性和向地。光合植物朝向光源通过弯曲向光性收获最大的能量。同样地，向重力使植物朝向重心生长。导致这些热带反应的基本机制涉及到植物激素生长素1的不对称形成梯度。当地生长素梯度的形成的行为被很好地表征;所涉及的这种机制的基因提供激素作用2-8的路线图。生长素流出载体，如个人识别码形成的（PIN）和P糖蛋白的特定位置，从细胞质到供体细胞9,10的细胞壁执行生长素的运动。 Furthermore，通过将活性的 H + / IAA同向转运生长素涌入载体，如AUX1 / LAX家族蛋白的活性，生长素最终递送到邻近的接收器单元2,11,12。生长素的这个方向的运动被称为极性生长素输送（PAT）。 PAT中各个发育阶段以及响应于不同的环境刺激13,14导致差分生长素分布。此外，在任何这些生长素流入或流出的载体的定位或表达的破坏导致的PAT严重改变，这会导致生长素梯度的破坏，导致发育缺陷。近日，韩寒等人 。报告说plasmodesmal调节也有必要保持生长素梯度15。迄今为止，已有30 plasmodesmal蛋白质已经确定了16个 。在这些蛋白质，AtGSL8已被报告为在胞间连丝（PD），用于胼胝质合成的关键酶，因此起着MAINT至关重要的作用癌宁对PD尺寸排阻极限（SEL）。压抑AtGSL8表达导致扭曲的生长素梯度图案导致在对比野生型幼苗15没有嗜响应。
在这份手稿，方法，探索参与PD调控提供了新的候选基因。 AtGSL8用作模型蛋白来测试这些方法，因为它是促进PD胼胝质的生物合成的关键酶。由于gsl8敲除突变体17秧苗杀伤力，地塞米松（DEX）诱导型的RNAi线按照使用了与以前公布的报告15。这里提供的策略可适于筛选了在用PD SEL受控胚轴嗜响应牵连的基因。
Protocol
Representative Results
Discussion
在此手稿，一个策略来筛选由于改变的PD胼胝质，因此，PD SEL中详细描述的突变体/过表达系是在向光性和向地响应缺陷的。 PD胼胝质合成和降解主要由胼胝质合成酶和β-1,3-葡聚糖酶来实现，但这些酶的调节是通过许多上游因素控制。要搜索这样的上游因素或直接参与PD调控的候选人，我们已建立了筛选此方法。这种设置有一些限制，调节PD胼胝质合成（gsl8）的一些关键酶的突变体是致命的<…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
韩国国家研究基金会（NRF-2015R1A2A1A10053576），这项研究得到支持，从下一代BioGreen 21计划的资助（SSAC，授予PJ01137901），农村振兴厅，韩国。 RK，WS，ABB和DK经脑韩国21 Plus计划（BK21 +）的支持。
Materials
| HPTS (8-Hydroxypyrene -1,3,6-trisulfonic acid trisodium salt) | Sigma | H1529-1G | Fluorescent dye as symplasmic tracer |
| LE Agarose | Dongin-Genomic | GEL001-500G | Used for HPTS agarose block |
| Microwave oven | LG-Goldstar | Machine for boiling agarose gel | |
| 100 mL glass conical flask | Dong Kwang | A0205 | Used to boil HPTS agarose gel |
| Petri Dish (35×10 mm) | SPL life sciences | SPL10035 | Used to make HPTS agarose blocks and wash plant samples |
| Microscope cover slides and glass slides (24 x 50 mm) | Marienfeld Laboratory Glassware | 101222 | Used for HPTS agarose blocks and microscopic sample preparation |
| MS medium plates 125 x 125 x 20 mm | SPL life sciences | SPL11125 | Plates to make MS agar medium |
| Scissors | Germany Stainless | HSB 942-11 | Used to excise hook region of plant samples |
| Murashige and Skoog (MS) basal salt mixture | Duchefa | P10453.01 | MS medium including vitamins. |
| (N-morpholino) ethanesulfonic acid (MES) monohydrate | Bioshop | 3G30212 | To make MS media. |
| Plant agar | Duchefa | P1001.1000 | To solidify MS media. |
| Autoclave | ALP | CL-40L | |
| Shaker | Wise Mix | SHO-1D | To wash off the aniline blue staining buffer and HPTS dye in a placid way. |
| 1 ml Blue tips | Sorenson | 10040 | |
| 1 ml pipette | BioPette | L-1101-2 | |
| Surgical tape | MIcropore | 1530-0 | To seal the MS plate |
| Aniline blue (Methyl blue) | Sigma | M5528-25G | Used to prepare aniline blue staining buffer. |
| Glycine | Bioshop | GLN001 | Used to prepare aniline blue staining buffer. |
| DDG | Sigma | D8375-1G | Used for the inhibition of callose synthases. |
| Confocal microscope | Olympus | FV1000MPE SIM | To check aniline blue staining and HPTS dye loading result. |
| Stirrer | I lab | K400 | To mix media solution. |
| Aluminium foil | SW cooking foil | To wrap plates in a dark condition. | |
| Sodium hypochlorite | Samjin Industry | To surface-sterilized seeds |
Riferimenti
- Went, F. W., Thimann, K. V., Bard, P. Phytohormones. Experimental biology monographs. , 204 (1937).
- Bennett, M. J., et al. Arabidopsis AUX1 gene: a permease-like regulator of root gravitropism. Science. 273 (5277), 948-950 (1996).
- Christensen, S. K., Dagenais, N., Chory, J., Weigel, D. Regulation of auxin response by the protein kinase PINOID. Cell. 100 (4), 469-478 (2000).
- Jurgens, G., Geldner, N. The high road and the low road: trafficking choices in plants. Cell. 130 (6), 977-979 (2007).
- Michniewicz, M., et al. Antagonistic regulation of PIN phosphorylation by PP2A and PINOID directs auxin flux. Cell. 130 (6), 1044-1056 (2007).
- Noh, B., Bandyopadhyay, A., Peer, W. A., Spalding, E. P., Murphy, A. S. Enhanced gravi- and phototropism in plant mdr mutants mislocalizing the auxin efflux protein PIN1. Nature. 423 (6943), 999-1002 (2003).
- Weijers, D., Friml, J. Snap Shot: auxin signaling and transport. Cell. 136 (6), 1172-1172 (2009).
- Wisniewska, J., et al. Polar PIN localization directs auxin flow in plants. Science. 312 (5775), 883 (2006).
- Murphy, A. S., Hoogner, K. R., Peer, W. A., Taiz, L. Identification, purification, and molecular cloning of N-1-naphthylphthalmic acid-binding plasma membrane-associated aminopeptidases from Arabidopsis. Plant Physiol. 128 (3), 935-950 (2002).
- Kleine-Vehn, J., Friml, J. Polar targeting and endocytic recycling in auxin-dependent plant development. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 24, 447-473 (2008).
- Yang, Y., Hammes, U. Z., Taylor, C. G., Schachtman, D. P., Nielsen, E. High-affinity auxin transport by the AUX1 influx carrier protein. Curr. Biol. 16 (11), 1123-1127 (2006).
- Geisler, M., Murphy, A. S. The ABC of auxin transport: the role of p-glycoproteins in plant development. FEBS Lett. 580 (4), 1094-1102 (2006).
- Band, L. R., et al. Root gravitropism is regulated by a transient lateral auxin gradient controlled by a tipping point mechanism. Proc. Natl. Acad. Sci.USA. 109 (12), 4668-4673 (2012).
- Vanneste, S., Friml, J. Auxin: a trigger for change in plant development. Cell. 136 (6), 1005-1016 (2009).
- Han, X., et al. Auxin-callose-mediated plasmodesmal gating is essential for tropic auxin gradient formation and signaling. Dev. Cell. 28 (2), 132-146 (2014).
- Kumar, R., Kumar, D., Hyun, T. K., Kim, J. Y. Players at plasmodesmal nano-channels. J. Plant Biol. 58, 75-86 (2015).
- Chen, X. Y., et al. The Arabidopsis callose synthase gene GSL8 is required for cytokinesis and cell patterning. Plant Physiol. 150, 105-113 (2009).
