Une stratégie pour valider le rôle des Callose médiée Plasmodesmal Gating dans la réponse Tropic

Summary

Cet article décrit les méthodes de criblage des gènes contrôlant la perméabilité plasmodesmal et gradient donc auxine pendant la réponse tropique. Cela inclut la mesure du degré de réponse à tropisme hypocotyle d'Arabidopsis thaliana et de vérifier la perméabilité plasmodesmal par l' acide 8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulfonique (HPTS) le chargement et l' évaluation du niveau finalement callose.

Abstract

L'auxine hormone végétale joue un rôle important dans de nombreux processus de croissance et de développement, y compris les réponses tropique à la lumière et la gravité. La mise en place d'un gradient d'auxine est un événement clé menant à phototropisme et gravitropisme. Auparavant, polaire transport de l'auxine (PAT) a été montré pour établir un gradient de auxine dans différents domaines cellulaires des plantes. Cependant, Han et al. , A récemment démontré que , pour la bonne formation du gradient de l' auxine, la connectivité plasmodesmal symplasmique callose à médiation entre les cellules adjacentes est également un facteur critique. Dans ce manuscrit, la stratégie visant à élucider le rôle des gènes particuliers, qui peuvent affecter phototropisme et gravitropisme en modifiant la connectivité symplasmique grâce à la modulation de la synthèse callose plasmodesmal, est discuté. La première étape consiste à filtrer les réponses tropique aberrantes de 3 jours-vieux plants étiolés de mutants ou surexpression lignes d'un gène ainsi que le type sauvage. Cet examen préliminairepeut conduire à l'identification d'une série de gènes fonctionnant en PAT ou contrôlant la connectivité symplasmique. La deuxième sélection comprend le tri des candidats qui montrent les réponses tropique modifiées en affectant la connectivité symplasmique. Pour remédier à de tels candidats, le mouvement d'un traceur symplasmique et le dépôt de callose plasmodesmal ont été examinés. Cette stratégie serait utile d'explorer de nouveaux gènes candidats qui peuvent réguler la connectivité symplasmique directement ou indirectement au cours des réponses tropique et d'autres processus de développement.

Introduction

Les plantes, comme les organismes vivants sessiles, ont développé un réseau très sophistiqué de la signalisation de cellule à cellule pour traiter divers stimuli environnementaux. Réponses tropique sont l'un des phénomènes par lequel les plantes répondent à des stimuli environnementaux. Les plantes montrent deux principales réponses trophiques, phototropisme et gravitropisme. plantes photosynthétiques courbent vers la source lumineuse par phototropisme pour récolter un maximum d'énergie. De même, gravitropisme rend les plantes à croître vers le centre de gravité. Le mécanisme fondamental qui conduit à ces réponses tropique implique asymétrique formation de gradient de la phytohormone auxine ^1. L'acte de formation de gradient de auxine locale est bien caractérisée; les gènes qui sont impliqués dans ce mécanisme constituent un plan d'action de l' hormone de ^2-8. La position spécifique des transporteurs d'efflux auxine, tels que PIN FORMÉ (PIN) et les glycoprotéines P, exécute le mouvement de l' auxine à partir du cytoplasme de la paroi cellulaire des cellules donneuses ^9,10. Far ailleurs, par la H ⁺ / AAI activité symport active des transporteurs d'afflux auxine, tels que les protéines de la famille LAX AUX1 /, l' auxine est finalement délivré aux cellules réceptrices adjacentes ^2,11,12. Ce mouvement directionnel d'auxine est connu comme transport de l'auxine polaire (PAT). PAT conduit à une distribution de l' auxine différentielle à divers stades de développement et en réponse à différents stimuli environnementaux ^13,14. En outre, la perturbation de la localisation ou l'expression de l'un de ces transporteurs d'efflux ou afflux auxine conduit à une altération sévère PAT, ce qui entraîne une perturbation du gradient de l'auxine, ce qui conduit à des défauts de développement. Récemment, Han et al. a rapporté que la réglementation plasmodesmal est également nécessaire de maintenir le gradient de auxine ^15. À ce jour, plus de 30 protéines plasmodesmal ont été identifiés ^16. Parmi ces protéines, AtGSL8 a été rapporté comme une enzyme clé pour la synthèse de callose à plasmodesmes (PD) et joue donc un rôle essentiel dans maintaining la limite PD d'exclusion de taille (SEL). AtGSL8 expression réprimée a donné lieu à un motif de gradient de auxine déformé conduisant à aucune réponse à tropisme contrairement aux plants de type sauvage ^15.

Dans ce manuscrit, les méthodes d'explorer de nouveaux gènes candidats qui sont impliqués dans la régulation de PD sont fournis. AtGSL8 a été utilisé comme protéine modèle pour tester ces méthodes, il est une enzyme clé qui contribue à la biosynthèse PD callose. En raison de la plantule létalité gsl8 de mutants knock-out ^17, la dexaméthasone (Dex) les lignes ont été utilisées inductible par ARNi selon un rapport publié antérieurement ^15. La stratégie fournie ici peut être adapté pour cribler des gènes qui sont impliqués dans la réponse hypocotyle tropic commandé par PD SEL.

Protocol

1. Dépistage des Mutants avec réponses phototropiques et gravitropique Altered Préparer 1x Murashige et Skoog (MS) Medium, pH 5,7, avec 0,8% Agar Un jour avant l'expérience. Ajouter 800 ml d'eau distillée deux fois à un 2 L fiole conique et remuer avec un barreau magnétique. Ajouter 4,4 g de MS sel dans la fiole conique. Ajouter 0,5 g de 2- (N-morpholino) l'acide éthanesulfonique (MES) et remuer jusqu'à ce que tous les sels sont complètement dissous. </li…

Representative Results

Dans la configuration actuelle, la dexaméthasone (dex) inductible par lignes ARNi de AtGSL8 [ci – après dsGSL8 (+ dex / -Dex)] ont été utilisés, comme les mutants d'insertion ADN-T gsl8 homozygotes sont des plantules létale 18. Trois jours-vieux plants étiolés de dsGSL8 et plants de type sauvage avec dex ± ont été exposés à des stimuli phototrophes et gravitropique. Nous avons constaté que dsGSL8 (+ dex) plantules …

Discussion

Dans ce manuscrit, une stratégie pour l'écran mutant / over-expression lignes qui sont défectueux dans les réponses phototrophes et gravitropique en raison de callose modifié PD et, par conséquent, PD SEL est décrite en détail. synthèse de callose PD et à la dégradation est principalement accomplie par synthases callose et β-1,3-glucanases, mais la régulation de ces enzymes est contrôlée par de nombreux facteurs en amont. Pour rechercher ces facteurs en amont ou les candidats qui sont directement impl…

Materials

HPTS (8-Hydroxypyrene -1,3,6-trisulfonic acid trisodium salt)	Sigma	H1529-1G	Fluorescent dye as symplasmic tracer
LE Agarose	Dongin-Genomic	GEL001-500G	Used for HPTS agarose block
Microwave oven	LG-Goldstar		Machine for boiling agarose gel
100 mL glass conical flask	Dong Kwang	A0205	Used to boil HPTS agarose gel
Petri Dish (35×10 mm)	SPL life sciences	SPL10035	Used to make HPTS agarose blocks and wash plant samples
Microscope cover slides and glass slides (24 x 50 mm)	Marienfeld Laboratory Glassware	101222	Used for HPTS agarose blocks and microscopic sample preparation
MS medium plates 125 x 125 x 20 mm	SPL life sciences	SPL11125	Plates to make MS agar medium
Scissors	Germany Stainless	HSB 942-11	Used to excise hook region of plant samples
Murashige and Skoog (MS) basal salt mixture	Duchefa	P10453.01	MS medium including vitamins.
(N-morpholino) ethanesulfonic acid (MES) monohydrate	Bioshop	3G30212	To make MS media.
Plant agar	Duchefa	P1001.1000	To solidify MS media.
Autoclave	ALP	CL-40L
Shaker	Wise Mix	SHO-1D	To wash off the aniline blue staining buffer and HPTS dye in a placid way.
1 ml Blue tips	Sorenson	10040
1 ml pipette	BioPette	L-1101-2
Surgical tape	MIcropore	1530-0	To seal the MS plate
Aniline blue (Methyl blue)	Sigma	M5528-25G	Used to prepare aniline blue staining buffer.
Glycine	Bioshop	GLN001	Used to prepare aniline blue staining buffer.
DDG	Sigma	D8375-1G	Used for the inhibition of callose synthases.
Confocal microscope	Olympus	FV1000MPE SIM	To check aniline blue staining and HPTS dye loading result.
Stirrer	I lab	K400	To mix media solution.
Aluminium foil	SW cooking foil		To wrap plates in a dark condition.
Sodium hypochlorite	Samjin Industry		To surface-sterilized seeds