Descriviamo un sistema di ovociti e cappucci animali di Xenopus per il clonaggio dell'espressione di geni in grado di indurre una risposta in un ectoderma competente, e discutiamo le tecniche per la successiva analisi di tali geni. Questo sistema è utile nell'identificazione funzionale di un'ampia gamma di prodotti genici.
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Articolo metodologico
Clonazione funzionale utilizzando un
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'identificazione dei geni responsabili dell'induzione embrionale pone una serie di sfide; per citarne alcune, le molecole secrete di interesse possono essere poco abbondanti, possono non essere secrete ma legate alle cellule di segnalazione, o possono richiedere la presenza di partner leganti o molecole regolatrici a monte. Pertanto, nella ricerca di prodotti genici in grado di suscitare una risposta precoce induttiva del lente, in un ectoderma competente, abbiamo utilizzato un sistema di clonaggio di espressione che consentisse l'identificazione di fattori paracrini o juxtacrin, nonché di proteine trascrizionali o di altre proteine regolatorie. Pool di mRNA sono stati iniettati negli ovociti di Xenopus e il tessuto rispondente è stato posizionato direttamente sugli ovociti e co-coltivato. A seguito del clonaggio funzionale di ldb1 da una libreria di cDNA allo stadio di placca neurale basata sulla sua capacità di suscitare l'espressione del marcatore precoce del placode del cristallino foxe3 in un ectoderma animale con cappuccio competente per il cristallino, abbiamo caratterizzato il pattern di espressione dell'mRNA e analizzato la progressione dello sviluppo in seguito a sovraespressione o knockdown di ldb1. Questo sistema è adatto in una varietà molto ampia di contesti in cui l'identificazione di un induttore o delle sue molecole regolatorie a monte è ricercata utilizzando una risposta funzionale in un tessuto competente.
Introduzione
Gli approcci genetici avanzati per identificare i geni di interesse attraverso la loro funzione o perdita di funzione1,2 sono parte integrante della comprensione di eventi di patterning complessi nello sviluppo. Accoppiato con potenti tecniche di genetica inversa disponibili per una gamma sempre più ampia di sistemi e ricercatori3-5, è ora possibile identificare i geni con un ruolo funzionale chiave in un percorso e quindi chiarire tale funzione a livello cellulare e in interazione con altri prodotti genici. Un approccio per identificare funzionalmente i geni di interesse che ha prodotto molte scoperte chiave in passato è il clonaggio di espres....
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Protocollo
Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dalla University of Virginia Istituzionale Animal Care and Use Committee.
Nota: la figura 1 mostra una panoramica schematica delle procedure sperimentali.
1. Preparazione di ovociti
- Pre-prime X. laevis femmine con 150 U di Pregnant Mare Serum gonadotropina (PMSG) circa una settimana di anticipo di isolamento degli ovociti. Iniettare 1 ml 150 U / ml PMSG in dorsale linfa sac con 1 cc siringa sterile con 29 ago G.
- Preparare le soluzioni per l'iniezione degli ovociti e degli ovociti animale cap....
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Risultati
In risposta alla espressione di mRNA iniettato in oociti, rispondendo tessuto protezione animale è stato analizzato per l'espressione di Otx2 mediante ibridazione in situ (Figura 2 e Tabella 1); Otx2 si esprime nella ectoderma lente presuntivo (PLE) da chiusura del tubo neurale attraverso la lente placode ispessimento 19. Tuttavia, poiché Otx2 si esprime anche nella ectoderma neurale anteriore, così come non-neurale ecto.......
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Discussione
Il metodo descritto qui per il clonaggio funzionale di geni capaci di indurre una risposta in ectoderma competente può essere utilizzato per identificare una vasta gamma di prodotti genici. Questo metodo si espande sul lavoro passato, combinando analisi dei tessuti che inducono con tecniche di clonazione espressione. Utilizziamo le vie metaboliche della oocita Xenopus come fonte di produzione di indurre fattori, direttamente o indirettamente, dopo l'iniezione di RNA. Questo, in combinazione con l'uso di.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione per lo sviluppo professionale a C.Z.P. dalla Shepherd University Foundation. Gli autori desiderano ringraziare Brett Zirkle e Malia Deshotel per le utili discussioni sui protocolli, e la dottoressa Carol Hurney per la generosa assistenza.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 12/101 Studi sullo sviluppo degli anticorpi | Banca degli ibridomi | 12/101 | Anticorpo monoclonale per la rilevazione del tessuto muscolare |
| 20x SSC Buffer | Sigma | S6639 | per ISH |
| Anidride acetica | Sigma | A6404 | per ISH |
| Anti-Dig-AP | Roche | 11093274910 | per ISH |
| Aurum Plasmid Mini Kit | Bio-Rad | 732-6400 | Purificazione del DNA plasmidico |
| Reagente bloccante | Roche | 11096176001 | per ISH |
| BM Purple | Roche | 11442074001 | per forno di |
| ibridazione ISH Boekel | Fisher Scientific | 13-245-121 | per ISH |
| Bouin's Solution | Sigma | HT10132 | per ISH |
| BSA | Sigma | A9647 | per OCM |
| CHAPS | Sigma | C3023 | per ISH |
| Collagenasi A | Roche 10103578001 | Defollicolazione degli ovociti | |
| Cisteina | Sigma | C121800 | embrioni Dejelly |
| DEPC-H2O | Fisher Scientific | BP5611 | per ISH |
| Dig-RNA Labeling Mix | Roche | 11277073910 | per sonde ISH |
| Pinze Dumont #5 | Precision Instruments | 500233 | per busta Vitelline rimozione |
| Etile 3-amminobenzoato | Sigma | A5040 | MS222 anestetico |
| Ficoll PM 400 | Sigma | F4375 | per mezzi di iniezione |
| Formamide | Sigma | F9037 | per ISH |
| Gentamicina solfato | Sigma | G1914 | per OCM |
| Capillari in vetro | World Precision Instruments | 4878 | 3,5" lungo, I, D, 0,530 mm |
| Fiale per campioni di vetro | Fisher Scientific | 06-408B | per ISH |
| Hair loop | Capelli apposti in pipetta pasteur per manipolazione tissutale | ||
| Eparina sale sodico | Sigma | H4784 | per ISH |
| Injector Nanoliter 2010 | World Precision Instruments | Nanoliter 2010 | Microiniettore controllato da microprocessore |
| Instant Ocean | Carolina | 972433 | Aquarium Salt per il recupero della rana |
| IRBG XGC Xenopus verificato full-length cam cDNA | Fonte Bioscience | 989_IRBG | libreria di cDNA |
| Piastre LB Agar con 100 µ g/ml Ampicillina | Teknova | L5004 | Piastre LB-Amp pre-versate da 150 mm per la selezione dei sib |
| LB Luria Brodo | Teknova | L8650 | LB per la raccolta di colonie nella selezione dei sib da piastre e la diluizione delle colture |
| Kit di isolamento magnetico dell'mRNA | New England BioLabs | S1550S | per l'isolamento dell'RNA arricchito di poli (A) |
| Acido maleico | Sigma | M0375 | per ISH |
| Micromanipolatore manuale Microfil World | Precision Instruments | M3310R | Micromanipolatore manuale |
| Miscelatore nutante | Fisher Scientific | 22-363-152 | Rocker per ISH |
| Permoplast | Nasco SB33495M | Clay per iniezione e dissezione | |
| Buffered Saline | Sigma | P5368 | per ISH |
| PMSG | Sigma | G4877 | per stimolare lo sviluppo degli ovociti |
| Polivinilpirrolidone | Sigma | PVP40 | per estrattore |
| programmabile | World Precision Instruments | PUL-1000 | Estrattore per aghi per micropipette |
| Proteinasi K | Sigma | P6556 | per ISH |
| pTnT Vector | Promega | L5610 | costruzione di librerie di cDNA |
| di combinazione Riboprobe | Promega | P1450 | in vitro Kit |
| costruzione di librerie di cDNA a lunghezza intera in apice | Kit | di 18248013 | Life Technologies per la costruzione di librerie di cDNA |
| Suture, seta 3-0 | Fisher Scientific | 19-037-516 | Filo e ago per sutura per la rimozione post-ovocita |
| Torula RNA | Sigma | R3629 | per ISH |
| Trietanolammina | Sigma | T1502 | per ISH |
| Tween 20 | Sigma | P9416 | per ISH |
| Universal RiboClone cDNA Synthesis System | Promega | C4360 | kit alternativo per la costruzione di librerie di cDNA |
| Xenopus Full ORF Entry Clones - ORFeome Collaboration | Source Bioscience | 5055_XenORFeome | ORFeome Clones |
| XL2-Blue Ultracompetent Cells | Agilent Technologies | 200150 | cellule per la trasformazione del cDNA biblioteca |
Riferimenti
- Yergeau, D., Kelley, C., Zhu, H., Kuliyev, E., Mead, P. Forward Genetic Screens in Xenopus. Using Transposon-Mediated Insertional Mutagenesis. Methods in Molecular Biology. 917, 111-127 (2012).
- Grainger, R.
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Ristampe e permessi
