DNA Electroporation لل، عزل والتصوير من Myofibers
Summary
This protocol utilizes electroporation to introduce and express fluorescently labeled proteins in mouse muscle fibers. Following recovery after electroporation, fibers are isolated. Individual fibers are then imaged using high resolution confocal microscopy to visualize muscle structure.
Abstract
Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently labeled proteins in the flexor digitorum brevis (FDB) muscle. Conditions have been optimized to provide a large number of high quality myofibers expressing the electroporated plasmid while minimizing muscle damage. The method employs fluorescent tags on various proteins. Combining this expression method with high resolution confocal microscopy permits live cell imaging, including imaging after laser-induced damage. Fluorescent dyes combined with imaging of fluorescently-tagged proteins provides information regarding the basic structure of muscle and its response to stimuli.
Introduction
myofibers الفردية هي خلايا المخلوي كبيرة، عالية التنظيم. هناك عدد قليل من النماذج خلية ثقافة العضلات. ومع ذلك، فإن هذه النماذج لديها كما قيدا رئيسيا على أنها لا تفرق تماما في myofibers ناضجة. على سبيل المثال، وتستمد خطوط الخلايا C2C12 وL6 من الفئران والجرذان على التوالي 1-4. في ظل ظروف المجاعة في الدم، وخلايا وحيدة النواة "شبيهة بالخلايا العضلية الجذعية" وقف انتشار الأسلحة النووية، تخضع لدورة الخلية الانسحاب، ويدخل في برنامج عضلي تشكيل خلايا متعددة النوى مع sarcomeres، ويشار إلى myotubes. مع الظروف الثقافة لفترات طويلة، قد myotubes يظهر خصائص مقلص و"نشل" في الثقافة. وقد جرى الآن أيضا إنشاء خطوط الخلايا البشرية 5. وبالإضافة إلى هذه خطوط الخلايا خلده، myoblasts وحيدات النوى يمكن عزلها عن العضلات وتحت ظروف مماثلة من الجوع الدم ستشكل myotubes. هذه خطوط الخلايا والثقافات بالخلايا العضلية الجذعية الأساسية هي استخدام عاليةفول لأنها يمكن أن تكون مع transfected البلازميدات أو transduced مع الفيروسات واستخدامها لدراسة العمليات البيولوجية الخلية الأساسية. ومع ذلك، هذه الخلايا، حتى عندما يسببها لتشكيل myotubes، تفتقر إلى العديد من الميزات البارزة لتنظيم العضلات ناضجة. على وجه التحديد، myotubes هي أصغر بكثير من myofibers ناضجة الفردية وتفتقر إلى الشكل الطبيعي للmyofibers. الأهم من ذلك، myotubes تفتقر عرضية (T-) الأنابيب، وشبكة غشائي اللازمة لكفاءة الكالسيوم 2+ إطلاق سراح جميع أنحاء هيولى عضلية.
طريقة بديلة لبالخلايا العضلية الجذعية الأولية أو خطوط الخلايا عضلي يستلزم استخدام myofibers ناضجة. ويمكن استخدام Transgenesis لإقامة التعبير عن البروتينات الموسومة، ولكن هذه الطريقة مكلفة وتستغرق وقتا طويلا. وقد برزت في الجسم الحي Electroporation للمن العضلات الماوس بوصفه الأسلوب المفضل لسرعته والموثوقية 10/06.
طرق لفي الجسم الحي Electroporation للوالعزلة الفعالة من myofibers هكتارلقد تم تحسين للماوس الباسطة للأصابع القصيرة (FDB) في العضلات 6. الأساليب يمكن أن تكتمل بسهولة وهم الغازية الحد الأدنى للحث في التعبير المجراة من البلازميدات. يتم الجمع بين هذا النهج الآن مع أساليب التصوير عالية الدقة بما في ذلك التصوير بعد انقطاع ليزر من 6،7 غمد الليف العضلي. مزيج من الأصباغ الفلورية والتعبير عن البروتينات fluorescently المسمى يمكن استخدامها لمراقبة العمليات الحيوية في الخلية myofibers ناضجة.
Protocol
Representative Results
Discussion
هي مناسبة للاستخدام Electroporation لللدراسة البروتينات الموسومة fluorescently في الجسم الحي مثالي لدراسة العضلات نظرا لعدم وجود نماذج خط الخلية المناسبة التي تحاكي بأمانة هيكل الخلية بأكملها من العضلات. يصف هذا البروتوكول استخدام Electroporation للوعالية الدقة متحد البؤر المجهر…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح NS047726، NS072027، وAR052646.
Materials
| DMEM+A2:D32D42A2:D31AA2:D29 | Life Technologies | 11995-073 | Dissection Media Dilution: 50ml +100g BSA |
| Collagenase, Type II | Life Technologies | 17101-015 | Fiber Digestion Dilution: 160mg / 4ml DMEM (stock 40mg/ml aliquot) |
| Falcon 12-well dishes | Fisher Scientific | 877229 | Fiber Digestion |
| Ringers Solution | Fiber Digestion and Imaging Dilution: 146 mM NaCl 5 mM KCl 2 mM CaCl2 1 mM MCl2 10mM HEPES pH7.4 in H2O |
||
| 1ml Pipettes | Axygen | T-1000-C-R | Digestion |
| Razor Blades | Personna | 94-120-71 | Digestion |
| Precision Glide 30G needle | BD Biosciences | 305128 | Dissection |
| 1x PBS (-/-) | Life Technologies | 14190-250 | Dissection |
| Sylgard 184 | Fisher Scientific | 50-366-794 | Dissection |
| Forceps | FST by Dumont | #5/45 | Dissection |
| Forceps | Roboz | RS-4913 | Dissection |
| Scissors | World Precision Instruments | 500260 | Dissection |
| BSA | Sigma | A7906 | Dissection media Dilution: 100mg / 50ml DMEM |
| Falcon 60mm dishes | Fisher Scientific | 08772B | Dissection- used to hold sylgard |
| Clay | Electroporation | ||
| Stimulator | Grass | s88x | Electroporation |
| Clamps | Radio Shack | 270-356 | Electroporation |
| Triadine | Aplicare | 82-220 | Electroporation |
| Precision Glide 27G needle | BD Biosciences | 305136 | Electroporation |
| Simulator | Grass | SIU-V | Electroporation |
| Gauze | Covidien | 2146 | Electroporation |
| Hyaluronidase | Sigma | H4272 | Injection Dilution: Add 160ul PBS (1X) to 40µl 5x stock |
| 1cc U-100 Insulin Syringe (28G1/2) | BD Biosciences | 329420 | Injection |
| Eppendorf Tubes | Fisher Scientific | 02-682-550 | Injection |
| 35mm glass bottom Microwell dish | MaTek | P35G-1.5-14-C | Microscopy |
| FM 4-64 | Life Technologies | T-13320 | Microscopy Dilution: Final 2.5 ug/ml |
| FM 1-43 | Life Technologies | T-35356 | Microscopy Dilution: Final 2.5 ug/ml |
| Endotoxinfree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | Plasmid Purification |
Riferimenti
- Blau, H. M., et al. Plasticity of the differentiated state. Science. 230, 758-766 (1985).
- Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270, 725-727 (1977).
- Richler, C., Yaffe, D. The in vitro cultivation and differentiation capacities of myogenic cell lines. Dev Biol. 23, 1-22 (1970).
- Yaffe, D. Retention of differentiation potentialities during prolonged cultivation of myogenic cells. Proc Natl Acad Sci USA. 61, 477-483 (1968).
- Mamchaoui, K., et al. Immortalized pathological human myoblasts: towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders. Skelet muscle. 1, 34 (2011).
- DiFranco, M., Quinonez, M., Capote, J., Vergara, J. DNA transfection of mammalian skeletal muscles using in vivo electroporation. J Vis Exp: JoVE. , (2009).
- Swaggart, K. A., et al. Annexin A6 modifies muscular dystrophy by mediating sarcolemmal repair. Proc Natl Acad Sci USA. 111, 6004-6009 (2014).
- Kerr, J. P., et al. Dysferlin stabilizes stress-induced Ca2+ signaling in the transverse tubule membrane. Proc Natl Acad Sci USA. 110, 20831-20836 (2013).
- Anderson, D. M., et al. A micropeptide encoded by a putative long noncoding RNA regulates muscle performance. Cell. 160, 595-606 (2015).
- Roche, J. A., et al. Physiological and histological changes in skeletal muscle following in vivo gene transfer by electroporation. Am J Physiol Cell Physiol. 301, C1239-1250 (2011).
- Reddy, A., Caler, E. V., Andrews, N. W. Plasma membrane repair is mediated by Ca(2+)-regulated exocytosis of lysosomes. Cell. 106, 157-169 (2001).
- Wang, B., et al. Membrane blebbing as an assessment of functional rescue of dysferlin-deficient human myotubes via nonsense suppression. J Appl physiol. 109, 901-905 (2010).
- Cai, C., et al. MG53 nucleates assembly of cell membrane repair machinery. Nat Cell Biol. 11, 56-64 (2009).
- Marg, A., et al. Sarcolemmal repair is a slow process and includes EHD2. Traffic. 13, 1286-1294 (2012).
- Bansal, D., et al. Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy. Nature. 423, 168-172 (2003).
- Defour, A., et al. Dysferlin regulates cell membrane repair by facilitating injury-triggered acid sphingomyelinase secretion. Cell Death Dis. 5, e1306 (2014).
