Questo protocollo utilizza l'elettroporazione per introdurre ed esprimere proteine marcate in fluorescenza nelle fibre muscolari del topo. Dopo il recupero dopo l'elettroporazione, le fibre vengono isolate. Le singole fibre vengono quindi visualizzate utilizzando la microscopia confocale ad alta risoluzione per visualizzare la struttura muscolare.
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Articolo metodologico
Elettroporazione DNA, isolamento e imaging di miofibre
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il muscolo maturo ha una struttura unica che è suscettibile di imaging di cellule vive. In questo articolo, descriviamo il protocollo sperimentale per l'espressione di proteine marcate in fluorescenza nel muscolo flessore breve delle dita (FDB). Le condizioni sono state ottimizzate per fornire un gran numero di miofibre di alta qualità che esprimono il plasmide elettroporato, riducendo al minimo il danno muscolare. Il metodo impiega tag fluorescenti su varie proteine. La combinazione di questo metodo di espressione con la microscopia confocale ad alta risoluzione consente l'imaging di cellule vive, compreso l'imaging dopo un danno indotto dal laser. I coloranti fluorescenti combinati con l'imaging di proteine marcate in fluorescenza forniscono informazioni sulla struttura di base del muscolo e sulla sua risposta agli stimoli.
Introduzione
Miofibre individuali sono grandi, le cellule sinciziale altamente organizzati. Ci sono alcuni modelli di coltura cellulare per il muscolo; tuttavia, questi modelli hanno come principale limitazione che non fanno differenza completamente in fibre muscolari mature. Ad esempio, le linee cellulari C2C12 e L6 sono derivati da topi e ratti, rispettivamente 1-4. In condizioni di deprivazione di siero, i mononucleari cellule "mioblasti-like" cessano proliferazione, subiscono il ritiro del ciclo cellulare, ed entrano nel programma miogenico che formano le cellule multinucleate con sarcomeri, indicati come miotubi. Con condizioni di coltura prolungata, miotubi pos....
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Protocollo
I metodi in questo studio sono stati eseguiti in conformità con l'etica Feinberg School of Medicine della Northwestern University Istituzionale Animal Care and Use Committee (IACUC) le linee guida approvate. Sono stati fatti tutti gli sforzi per ridurre al minimo le sofferenze.
Procedura sperimentale 1. per elettroporazione in vivo del flessore Brevis (FDB) Muscle Bundle in mouse
- Plasmidi di progettazione per l'espressione in vivo utilizzando un promotore saputo esprimere in cellule di mammifero (ad esempio, citomegalovirus, CMV) o nel muscolo (ad esempio, Muscolo Creatina chinasi, MCK) ....
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Risultati
Elettroporazione è una tecnica minimamente invasiva che introduce efficacemente purificato plasmide DNA nel flessore brevis (FDB) fascio muscolare (Figura 1A). Sette giorni dopo la transfezione fluorescently proteina tag viene visualizzato nella miofibre isolate (Figura 1B). Fibre isolate sono poi placcati e preparate per l'imaging su un microscopio confocale. Le fibre possono essere sottoposti a lesione indotta da laser. Colorante FM può essere util.......
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Discussione
L'utilizzo di elettroporazione per studiare le proteine fluorescenti tag in vivo è ideale per lo studio del muscolo in assenza di opportuni modelli di linee cellulari che riproducono fedelmente l'intera struttura cellulare del muscolo. Questo protocollo descrive l'utilizzo di elettroporazione e ad alta risoluzione microscopia confocale a fornire immagini dettagliate di localizzazione delle proteine e la traslocazione dopo ferimento laser. Questo metodo può essere adattato per studiare altri proc.......
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Dichiarazioni
Non ci sono conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health concede NS047726, NS072027, e AR052646.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| DMEM | Life Technologies | 11995-073 | Terreni di dissezione Diluizione: 50 ml +100 g |
| di collagenasi BSA, tipo II | Life Technologies | 17101-015 | Digestione delle fibre Diluizione: 160 mg / 4 ml DMEM (aliquota stock 40 mg/ml) |
| Piastre Falcon a 12 pozzetti | Fisher | Scientific 877229 | Fiber Digestion |
| Ringers Solution | Diluizione e imaging delle fibre: 146 mM NaCl 5 mM KCl 2 mM CaCl2 1 mM MCl2 10 mM HEPES pH7.4 in H2O | ||
| 1 ml Pipette | Axygen | T-1000-C-R | Digestione |
| Lamette da barba | Personna | 94-120-71 | Digestione |
| Precision Glide 30 G ago | BD Biosciences | 305128 | Dissezione |
| 1x PBS (-/-) | Life Technologies | 14190-250 | Dissezione |
| Sylgard 184 | Fisher Scientific | 50-366-794 | dissezione |
| FST di Dumont | #5/45 | per dissezione | |
| Roboz | RS-4913 | per dissezione | |
| World Precision Instruments | 500260 | Dissezione | |
| BSA | Sigma | A7906 | Terreni di dissezione Diluizione: 100 mg/50 ml DMEM |
| Falcon Piastre da 60 mm | Fisher Scientific | 08772B | Dissezione - utilizzato per contenere lo |
| elettroporazione | dell'argilla | ||
| Grass | s88x | elettroporazione | |
| Radio Shack | 270-356 | Elettroporazione | |
| Triadine | Aplicare | 82-220 | Elettroporazione |
| Precision Glide 27 G ago | BD Biosciences | 305136 | Simulatore di elettroporazione |
| Grass | SIU-V | elettroporazione | |
| Covidien | 2146 | Elettroporazione | |
| Ialuronidasi | Sigma | H4272 | Iniezione Diluizione: aggiungere 160 ul PBS (1x) a 40 µ l 5x |
| stock 1 cc Siringa da insulina U-100 (28G1/2) | BD Biosciences | 329420 | Iniezione |
| di provette Eppendorf | Fisher Scientific | 02-682-550 | Iniezione |
| 35 mm fondo in vetro Piastra per micropozzetti | MaTek | P35G-1.5-14-C | Microscopia |
| FM 4-64 | Life Technologies | T-13320 | Microscopia Diluizione: Finale 2,5 ug/ml |
| FM 1-43 | Life Technologies | T-35356 | < br/> Diluizione: Maxi Kit Plasmidico Finale 2,5 ug/ml |
| Endotossine | Qiagen | 12362 | Purificazione Plasmidico |
Riferimenti
- Blau, H. M., et al. Plasticity of the differentiated state. Science. 230, 758-766 (1985).
- Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270, 725-727 (1977).
- Richler, C., Yaf....
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Ristampe e permessi
