Generering CRISPR / Cas9 mediert Monoallelic Slett å studere Enhancer funksjon i mus embryonale stamceller

Summary

Experimental validation of enhancer activity is best approached by loss-of-function analysis. Presented here is an efficient protocol that uses CRISPR/Cas9 mediated deletion to study allele-specific regulation of gene transcription in F1 ES cells which contain a hybrid genome (Mus musculus¹²⁹ x Mus castaneus).

Abstract

Enhancers control cell identity by regulating tissue-specific gene expression in a position and orientation independent manner. These enhancers are often located distally from the regulated gene in intergenic regions or even within the body of another gene. The position independent nature of enhancer activity makes it difficult to match enhancers with the genes they regulate. Deletion of an enhancer region provides direct evidence for enhancer activity and is the gold standard to reveal an enhancer’s role in endogenous gene transcription. Conventional homologous recombination based deletion methods have been surpassed by recent advances in genome editing technology which enable rapid and precisely located changes to the genomes of numerous model organisms. CRISPR/Cas9 mediated genome editing can be used to manipulate the genome in many cell types and organisms rapidly and cost effectively, due to the ease with which Cas9 can be targeted to the genome by a guide RNA from a bespoke expression plasmid. Homozygous deletion of essential gene regulatory elements might lead to lethality or alter cellular phenotype whereas monoallelic deletion of transcriptional enhancers allows for the study of cis-regulation of gene expression without this confounding issue. Presented here is a protocol for CRISPR/Cas9 mediated deletion in F1 mouse embryonic stem (ES) cells (Mus musculus¹²⁹ x Mus castaneus). Monoallelic deletion, screening and expression analysis is facilitated by single nucleotide polymorphisms (SNP) between the two alleles which occur on average every 125 bp in these cells.

Introduction

Transkripsjonsregulerende elementer er avgjørende for rom-tid-finjustering av genuttrykk under utvikling ^en og modifikasjon av disse elementene kan føre til sykdom på grunn av avvikende genuttrykk ^to. Mange sykdomsassosierte regioner identifisert av genom brede assosiasjonsstudier er i ikke-kodende regioner og har funksjoner av transkripsjonsforsterkere ^3-4. Identifisere Forsterker og matche dem med genene de regulerer er komplisert som de ofte ligger flere kilobaser bort fra genene de regulerer og kan aktiveres i en vev-spesifikk måte ^5-6. Enhancer spådommer er ofte basert på histone modifikasjon merker, mediator-cohesin komplekser og binding av celletype-spesifikke transkripsjonsfaktorer ^7-10. Validering av forutsagte enhancers gjøres oftest gjennom en vektor basert analyse hvor forsterkeren aktiverer ekspresjon av et reportergen ^11-12. Disse dataene gir valuable informasjon om regulatoriske potensialet antatte forsterkersekvenser, men ikke avsløre sin funksjon i deres endogene genomisk kontekst eller identifisere genene de regulerer. Genome redigering fungerer som et kraftig verktøy for å studere funksjonen til transkripsjonsregulerende elementer i deres endogene sammenheng med tap-av-funksjon analyse.

Nylige fremskritt innen genom redigering, nemlig CRISPR / Cas9 genom redigering systemet, lette etterforskningen av genomet funksjon. Den CRISPR / Cas9 systemet er enkelt å bruke og kan tilpasses for mange biologiske systemer. Den Cas9 protein er rettet mot et bestemt sted i genomet av en guide RNA (gRNA) ^13. Den SpCas9 / gRNA komplekse skanner genomet for sin target genomisk sekvens som må være 5 'til en protospacer tilstøtende motiv (PAM) sekvens, NGG ^14-15. Base sammenkobling av gRNA til sitt mål, en 20 nukleotid (nt) sekvens komplementær til gRNA, aktiverer SpCas9 nukleaseaktiviteten resulterer i en dobbee tråd pause (DSB) 3 bp oppstrøms for PAM-sekvensen. Spesifisitet oppnås ved fullstendig baseparing i den gRNA frø regionen, 6-12 nt tilstøtende til PAM; omvendt, ikke samsvarer med 5 'av frøet blir vanligvis tolereres ^16-17. Den introduserte DSB kan repareres enten ved ikke-homolog ende bli (NHEJ) DNA reparasjon eller homologi rettet reparasjon (HDR) mechanisms.NHEJ DNA-reparasjon ofte skaper innsetting / sletting (indels) av noen bp på målstedet som kan forstyrre den åpne leseramme (ORF) av et gen. For å generere større slettinger i genomet to gRNAs, som flankerer regionen av interesse, kan brukes ^18-19. Denne fremgangsmåten er spesielt nyttig for studiet av transkripsjonsforsterkere som smyger seg inn i locus kontrollregioner eller super-forsterkere som er større enn konvensjonelle forsterkere ^9,18,20-22.

Monoallelic slettinger er en verdifull modell for å studere cis -regulation av transkripsjon. Den observerte change i transkripsjon nivå etter monoallelic sletting av en forsterker korrelerer til rollen som forsterker i genregulering uten konfunderende effekter som kan oppstå når transkripsjon av begge alleler påvirkes potensielt påvirke celle fitness. Vurderer redusert uttrykk er vanskelig men uten evne til å skille slettet fra villtype-allelet. Videre genotyping slettinger i hvert allel uten evne til å skille de to alleler er krevende, særlig for store delesjoner av> 10 kb til en Mb ²³ i hvilken det er vanskelig å forsterke hele villtype-regionen med PCR. Bruken av F1 ES-celler som genereres av krysset Mus musculus ¹²⁹ med Mus castaneus gjør at to alleler lett å skille allel-spesifikk PCR ^18,24. Den hybride genomet i disse cellene letter allel-spesifikk delesjon og ekspresjon screening-analyse. I gjennomsnitt er det en SNP hver 125 bp mellom disse to genomer, Som gir fleksibilitet i primer design for uttrykk og genotyping analyser. Tilstedeværelsen av en SNP kan påvirke tennsatsen smeltetemperaturen (T _m) og rettet mot spesifisitet i sanntid kvantitativ PCR (qPCR) amplifikasjon slik at for diskriminering av de to allelene ^25. Videre er en mistilpasning i 3'-enden av primeren har stor innvirkning på evnen av DNA-polymerase for å strekke seg fra primeren å forhindre forsterkning av den uønskede allel målet ^26. Beskrevet i følgende protokoll er bruk av F1 ES-celler for allel spesifikk forsterkningsslettinger som er større enn 1 kb og påfølgende uttrykk analyse ved hjelp av CRISPR / Cas9 genom redigering systemet (figur 1).

Figur 1. Enhancer sletting bruker CRISPR / Cas9 å studere cis -reggler av genuttrykk. (A) F1 ES-celler som genereres av en krysning mellom Mus musculus ¹²⁹ og Mus castaneus brukes til å tillate for allel bestemt sletting. (B) To førings RNA (gRNA) blir brukt for å indusere en stor Cas9-mediert sletting av forøker regionen. (C) Primer sett brukes for å identifisere store mono- og bi-allele delesjoner. De oransje primere er inne primere, lilla primere er utenfor primere og de grønne primere blir gRNA flankerer primere. (D) Endringer i genuttrykk overvåkes ved hjelp av allel-spesifikk qPCR. RFU betegner relative fluorescens enheter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Protocol

1. designe og konstruere den gRNA Slik sletter transkripsjons enhancer regioner bruke to gRNAs, en 5 'og en 3 "av regionen av interesse. Bruk musen UCSC genom nettleser spor som genereres av Zhang laboratoriet for å identifisere unike gRNA sekvenser (http://www.genome-engineering.org 15). Neste sjekke disse gRNAs og deres tilstøtende PAM for SNPs og indels bruker elektroniske verktøy levert av Sanger Institute (www.sanger.ac.uk/sanger/Mouse_SnpViewer/rel-1211) 27-28. For å m…

Representative Results

Protokollen er beskrevet her bruker F1 ES-celler til å studere cis -regulation av genuttrykk i monoallelic enhancer slettet celler generert ved hjelp CRISPR / Cas9 genom redigering (figur 1). Den gRNA og allel-spesifikk primer design for genotyping og genekspresjon er de viktigste faktorene i denne tilnærmingen. Hver allel-spesifikk primer sett må valideres av qPCR å bekrefte allel spesifisitet. Allel-spesifikke primere som forsterker bare deres respektive g…

Discussion

CRISPR / Cas9 formidlet genom redigering teknologien gir en enkel, rask og billig metode for genom modifikasjon. Metoden beskrevet her for å generere og analysere monoallelic Enhancer sletting for funksjonell Enhancer karakterisering dro fordel av SNPs i F1 museceller. Fordelene med denne typen metode er: 1) monoallelic enhancer delesjoner ikke frembringer samtidig andre virkninger som oppstår når et kritisk enhancer er slettet fra begge allelene, det vil si, en stor reduksjon i protein nivåene av det regul…

Materials

Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	NEB	M0530S	high fidelity DNA polymerase used in gRNA assembly
Gibson Assembly Master Mix	NEB	E2611L
gRNA_Cloning Vector	Addgene	41824	A target sequence is cloned into this vector to create the gRNA plasmid
pCas9_GFP	Addgene	44719	Codon-optimized SpCas9 and EGFP co-expression plasmid
AflII	NEB	R0520S
EcoRI	NEB	R3101S
Neon Transfection System 100 µL Kit	Life Technologies	MPK10096	Microporator transfection technology
prepGEM	ZyGEM	PT10500	genomic DNA extraction reagent
Nucleo Spin Gel & PCR Clean-up	Macherey-Nagel	740609.5
High-Speed Plasmid Mini Kit	Geneaid	PD300
Maxi Plasmid Kit Endotoxin Free	Geneaid	PME25
SYBR select mix for CFX	Life Technologies	4472942	qPCR reagent
iScript cDNA synthesis kit	Bio-rad	170-8891	Reverse transcription reagent
0.25% Trypsin with EDTA	Life Technologies	25200072
PBS without Ca/Mg2+	Sigma	D8537
0.5M EDTA	Bioshop	EDT111.500
HBSS	Life Technologies	14175095
1M HEPES	Life Technologies	13630080
BSA fraction V (7.5%)	Life Technologies	15260037
Max Efficiency DH5α competent cells	Invitrogen	18258012
FBS	ES cell qualified		FBS is subjected to a prior testing in mouse ES cells for pluripotency
DMSO	Sigma	D2650
Glutamax	Invitrogen	35050
DMEM	Life Technologies	11960069
Pencillin/Streptomycin	Invitrogen	15140
Sodium pyruvate	Invitrogen	11360
Non-essential aminoacid	Invitrogen	11140
β-mercaptoethanol	Sigma	M7522
96-well plate	Sarstedt	83.3924
Sealing tape	Sarstedt	95.1994
CoolCell LX	Biocision	BCS-405	alcohol-free cell freezing container
CHIR99021	Biovision	1748-5	Inhibitor for F1 ES cell culture
PD0325901	Invivogen	inh-pd32	Inhibitor for F1 ES cell culture
LIF	Chemicon	ESG1107	Inhibitor for F1 ES cell culture