Um modelo de cultura de fatia organotipica de glioblastoma humano para estudo de migração de células tumorais e efeitos específicos de pacientes de drogas anti-invasivas
Summary
Os modelos atuais ex vivo de glioblastoma (GBM) não são otimizados para o estudo fisiologicamente relevante da invasão de tumores humanos. Aqui, apresentamos um protocolo para geração e manutenção de culturas de fatia organotípicas a partir de tecido GBM humano fresco. É fornecida uma descrição da microscopia por lapso de tempo e técnicas quantitativas de análise de migração celular.
Abstract
Glioblastoma (GBM) continua a apresentar um prognóstico clínico extremamente fraco, apesar da terapia cirúrgica, quimioterapêutica e de radiação. A invasão progressiva do tumor no parênquima cerebral circundante representa um desafio terapêutico duradouro. Para desenvolver terapias anti-migração para GBM, os sistemas modelo que fornecem um fundo fisiologicamente relevante para experimentação controlada são essenciais. Aqui, apresentamos um protocolo para a geração de culturas de fatia de tecido GBM humano obtido durante ressecção cirúrgica. Essas culturas permitem a experimentação ex vivo sem passar por meio de xenoenxertos de animais ou culturas de células únicas. Além disso, descrevemos o uso da microscopia confocal de varredura a laser em lapso temporal em conjunto com o rastreamento celular para estudar quantitativamente o comportamento migratório das células tumorais e resposta associada à terapêutica. As fatias são reproduzíveis geradas dentro de 90 minutos da aquisição de tecido cirúrgico. Células fluorescentes mediadas por RetrovirallyAs imagens de imagem confocal e de migração de células tumorais são posteriormente concluídas dentro de duas semanas de cultura. Nós usamos com sucesso essas culturas de fatia para descobrir fatores genéticos associados ao aumento do comportamento migratório no GBM humano. Além disso, validamos a capacidade do modelo para detectar variações específicas do paciente em resposta a terapias anti-migração. Avançando, as culturas de fatia GBM humanas são uma plataforma atraente para uma avaliação rápida e ex vivo da sensibilidade do tumor a agentes terapêuticos, a fim de promover a terapia neurocircóológica personalizada.
Introduction
O estudo laboratorial do glioblastoma (GBM) é dificultado pela falta de modelos que recapitulem fielmente as características patológicas necessárias da doença humana, nomeadamente a migração de células tumorais e a invasão. Estudos comparativos de ensaios de invasão in vitro 2D e 3D, bem como modelos de cultura de fatias de roedores 3D, descobriram programas de migração celular mecanicamente dispares nestes dois contextos, potencialmente limitando a translatabilidade dos achados dos sistemas 2D à doença humana 1 , 2 , 3 . O paradigma de cultura e imagem de corte de tumor organotípico aqui descrito permite o estudo da migração de células tumorais em fatias de tecido de tumor humano ex vivo obtido a partir de ressecção cirúrgica. Assim, as culturas de fatia de tecido tumoral ressecado cirurgicamente em conjunto com microscopia confocal de lapso de tempo fornecem uma plataforma para estudar a migração de células tumorais no nativoMicroambiente sem dissolução de tecido ou passagem de cultura.
Existe uma extensa literatura que emprega modelos de cultura de fatias de cérebros de roedores de GBM gerados a partir de xenoenxertos de tumores humanos, tumores induzidos por retrovirais e sobreposições celulares para estudar invasão tumoral 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . Recentemente, vários grupos descreveram a geração de culturas de fatia organotípicas diretamente do tecido GBM humano 6 , 7 , 8 , 9 , 10 . No entanto, existe uma variação acentuada entre os protocolos publicados em relação à técnica de corte e aos meios de cultura. Além disso, o uso de culturas de fatias organotipicas se concentrou em pontos finais experimentais estáticos que incluíram mudanças no sinal celularNg, proliferação e morte. O protocolo aqui descrito expande sobre paradigmas de cultura de fatia anteriores, incorporando observação resolvida no tempo de comportamentos dinâmicos de células tumorais através de microscopia confocal de varredura laser com lapso de tempo. A descoberta recente de inter 11 e intratumoral 12 , 13 variação genética no GBM humano ressalta a importância de vincular essa heterogeneidade com os comportamentos das células tumorais e suas implicações na resposta do tumor à terapia. Aqui, relatamos um protocolo simplificado e reprodutível para o uso de culturas de fatia diretas de um tecido de câncer humano para visualizar migração de células tumorais em tempo quase em tempo real.
Protocol
Representative Results
Discussion
As culturas de fatias organotípicas de tecido de câncer humano fornecem uma plataforma atraente e subutilizada para experimentação pré-clínica de tradução. Não existe conhecimento dos comportamentos a nível populacional das células tumorais no que diz respeito à migração, proliferação e morte celular no microambiente do tumor nativo. Criticamente, estudar a resposta tumoral à terapia de forma dinâmica e resolvida no tempo ao nível do comportamento celular pode esclarecer novos mecanismos de resistênc…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer ao Dr. Lee Niswander e ao Dr. Rada Massarwa por sua experiência técnica e contribuições para o protocolo de imagem confocal de cultura de fatia descrito aqui. Além disso, graças ao Dr. Kalen Dionne, que forneceu conhecimentos sobre como otimizar o corte de tecido cerebral e os parâmetros de cultura.
Materials
| DMEM High Glucose | Invitrogen (Gibco) | 11960-044 | |
| Neurobasal-A Medium, minus phenol red | Invitrogen (Gibco) | 12349-015 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Invitrogen (Gibco) | 17504-044 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Invitrogen (Gibco) | 15140-122 | |
| GlutaMAX Supplement | Invitrogen (Gibco) | 35050-061 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Invitrogen (Gibco) | 25030-081 | |
| HEPES (1 M) | Invitrogen (Gibco) | 15630-080 | |
| Nystatin Suspension | Sigma-Aldrich | N1638-20ML | 10,000 unit/mL in DPBS, aseptically processed, BioReagent, suitable for cell culture |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen (Gibco) | 16520-050 | Melts at 65.5 C, Remains fluid at 37 C, and sets rapidly below 25 C. |
| Isolectin GS-IB4 from Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 647 Conjugate | Thermo Fisher (Molecular Probes) | I32450 | Used in media to label Microglia/Macrophages |
| pRetroX-IRES-ZsGreen1 Vector | Clonetech | 632520 | |
| Retro-X Concentrator | Clonetech | 31455 | Binding resin for non-ultracentrifugation concentration of viral supernatants |
| pVSG-G Vector | Clonetech | 631530 | part of the Retro-X Universal Retroviral Expression System |
| GP2-293 Viral packaging cells | Clonetech | 631530 | part of the Retro-X Universal Retroviral Expression System |
| Cyanoacrylate Glue (Super Glue) | Sigma-Aldrich | Z105899 | Medium-viscosity |
| Equipment | |||
| Peel-A-Way Embedding Mold (Square – S22) | Polysciences, Inc. | 18646A-1 | Molds for tumor sample embedding |
| Stainless Steel Micro Spatulas | Fisher Scientific | S50823 | Bend instrument 45 degrees at the neck of the spoon blade |
| Curved Fisherbrand Dissecting Fine-Pointed Forceps | Fisher Scientific | 08-875 | |
| Single Edge Razor Blade (American Safety Razors) | Fisher Scientific | 17-989-001 | Blade edge is 0.009" thick. Crimped blunt-edge cover is removed before loading onto vibratome. |
| Leica VT1000 S Vibratome | Leica Biosystems | VT1000 S | |
| Hydrophilic PTFE cell culture insert | EMD Millipore | PICM0RG50 | 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm pore size |
| 35 mm Glass Bottom Dishes | MatTek | P35G-1.5-20-C Sleeve | 20mm glass diameter. Coverslip glass thickness 1.5 |
| LSM 510 Confocal Micoscope | Zeiss | LSM 510 | 10x Air Objective (c-Apochromat NA 0.45) |
| PECON Stagetop Incubator | PeCON Germany | (Discontinued) | Incubator PM 2000 RBT is a comprable product designed for use with Zeiss Microscopes. |
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