Bewertung der Planar-Cell-Polarity Phänotypen in Ziliopathie Maus-Mutanten-Cochlea
Summary
Primary cilia influence various signaling pathways. The mammalian cochlea is ideal for examining planar cell polarity (PCP) signaling. Cilia dysfunction affects cochlear outgrowth, cellular patterning and hair cell orientation, readouts of PCP. Our goal is to analyze PCP signaling in mouse cochlea via phenotypic analysis, immunohistochemistry and scanning electron microscopy.
Abstract
In recent years, primary cilia have emerged as key regulators in development and disease by influencing numerous signaling pathways. One of the earliest signaling pathways shown to be associated with ciliary function was the non-canonical Wnt signaling pathway, also referred to as planar cell polarity (PCP) signaling. One of the best places in which to study the effects of planar cell polarity (PCP) signaling during vertebrate development is the mammalian cochlea. PCP signaling disruption in the mouse cochlea disrupts cochlear outgrowth, cellular patterning and hair cell orientation, all of which are affected by cilia dysfunction. The goal of this protocol is to describe the analysis of PCP signaling in the developing mammalian cochlea via phenotypic analysis, immunohistochemistry and scanning electron microscopy. Defects in convergence and extension are manifested as a shortening of the cochlear duct and/or changes in cellular patterning, which can be quantified following dissection from developing mouse mutants. Changes in stereociliary bundle orientation and kinocilia length or positioning can be observed and quantitated using either immunofluorescence or scanning electron microscopy (SEM). A deeper insight into the role of ciliary proteins in cellular signaling pathways and other biological phenomena is crucial for our understanding of cellular and developmental biology, as well as for the development of targeted treatment strategies.
Introduction
Primäre Zilien sind lang Mikrotubuli-basierte Fortsätze, die von der Oberfläche der meisten Säugerzellen erstrecken. Primäre Zilien sind oft mit motile Zilien, von denen verwechselt gibt es immer mehrere pro Zelle, und deren Zweck es ist Fluids über Membranoberflächen zu bewegen. Primäre Zilien, dagegen annehmen sensorischen Rollen und sind somit auch als Sinneshärchen bezeichnet. Nachdem lange vergessen hat diese Organellen vor kurzem als Ergebnis seiner Verbindung mit einer Vielzahl von menschlichen genetischen Erkrankungen ein "wiederentdeckt" worden. Idealerweise als Signalorganelle angeordnet ist, hat der primäre cilium wurden zahlreiche Signalwege gezeigt zu regeln, von denen viele nicht nur wichtig in Gewebshomöostase und Krankheit, sondern auch während der Entwicklung 2.
Einer der ersten Signalwege gezeigt mit Zilien Dysfunktion assoziiert zu sein war der nicht-kanonischen Wnt-Signalwegs, auch bekannt als die planare Zellpolarität (PCP) Weg <sup > 3. Diese Signalkaskade zunächst in Drosophila identifiziert, ist entscheidend für die Embryogenese; insbesondere zur Konvergenz und Ausdehnung Prozesse und für die korrekte Ausrichtung der Zellen in der Ebene der Epithelien 4. Die sequentielle Signalisierung einer Kernsatz von regulatorischen Proteinen übersetzt Richtungshinweise, die letztlich zu Zytoskelett-Umlagerungen führen und 5 in die koordinierte Polarisation von Epithelzellen in einer Ebene zur Folge haben. Der Prozess der Annäherung und Erweiterung ist absolut für den Schneckengang erforderlich zu verlängern und für die korrekte zelluläre Muster 6. Da dies über die Aktivierung des PCP Wegs reguliert wird, eines der markantesten Phänotypen der Mutanten Cochlea PCP ist eine verkürzte Schneckengang mit desorganisiert Sinnesepithelien 7. Ebenso Mausmutanten, die Wimpern fehlen, zeigen auch eine solche Konvergenz und Erweiterung Phänotyp 8,9, obwohl genau, wie dies geregelt ist noch nicht geklärt werden.
ve_content "> Da Prozesse Konvergenz und Erweiterung entscheidend sind für das Auswachsen der Schneckengang und Mobil Strukturierung der Sinnesepithelien im Schneckengang, die Entwicklung von Cochlea ist eine ideale Organ, in dem PCP-Signalisierung während der Wirbeltierentwicklung zu untersuchen. Die Orgel von Corti, der Begriff der Fach Sinnesepithel gegeben, die Linien der Schneckengang, der nicht-Sinnesstützzellen und mechanosensorischen Haarzellen besteht, die einheitlich für die Schnecke ausgerichtet sein muss 10 zu funktionieren. die mechanosensorischen Haarzellen sind so, weil die angerufene stereociliary Bündel, die von der Kutikula Platte (Spitzenfläche) jedes Haarsinneszelle 11. Diese dienen als Primärwandler Mechanosensation und trotz ihrer Nomenklatur als Stereozilien verlängern, sind tatsächlich von modifizierten Aktin-Filament-basierte Mikrovilli umfasste. Innerhalb jeder winkelförmige Haar Bündel, drei Reihen von Stereozilien sind in einem hoch geordneten und regelmäßigen pa organisiertttern in einem Treppenhaus artig. Echt Mikrotubuli-basierte Zilien, bezeichnet Kinozilien, werden für die Entwicklung und die Ausrichtung der stereociliary Bündel 12 erforderlich. Bei jeder Haarzelle wird eine Einzel Kinozilium physisch an den Stereozilien Bündel befestigt, befindet sich auf dem höchsten Reihe von Stereozilien zentral nebeneinander. Die genaue Funktion des Kinozilium ist unklar, und eine Hypothese ist, dass die Kinozilium die Stereozilien in Form "zieht", wie sie von Mikrovilli 12 reifen. Bei Wirbeltieren sind Kinozilien in der Cochlea vorhanden nur vorübergehend und von den Haarzellen in Mäusen zurückzuziehen vor dem Einsetzen 11,13,14 hören.Vollständiger Verlust von Zilien in den Entwicklungs Cochlea führt zu stark verkürzt Cochlea Kanäle, mis geformt und mis orientierten stereociliary Bündel sowie Fehl positioniert Basalkörpern 8,9. Eine funktionelle Cilium ist nicht nur der Ciliar- Axonem umfasste. Viele Proteine mit Zilien verbundenFunktion kommen in Komplexen lokalisiert Zilien bezogene Sub-Domains wie beispielsweise die Basaltemperatur, Übergangszone oder Ciliar- Axonem 15. Der Grundkörper, von der Mutter centriole der Zentrosom abgeleitet, ist auch ein Mikrotubuli-Organisationszentrum für Mikrotubuli aus dem Flimmer in dem Zellkörper weg erstreckt und intrazellulären Transport sowie Ciliar- Handel regulieren. Die Ciliar- Übergangszone ist ein weiterer Bereich, in dem Ziliarfunktion in Bezug auf 16 der Organisation von Import und Export von Ciliar- Verbindungen reguliert wird.
Mehrere Studien haben einen Zusammenhang zwischen Wimpern und nicht-kanonische Wnt (PCP-Signalisierung) identifiziert, obwohl der genaue Mechanismus 17 ist unklar. Redundanz von Ciliar- und PCP-Gene und die Empfindlichkeit der Zellpolarität zu verallgemeinern Zellanomalien, machen es schwierig, direkt eine Mutation an PCP spezifische Defizite zu verknüpfen. Einer der Lese outs von PCP-Signalisierung ist die Positionierung der Basaltemperatur und primary Flimmer, damit die primären von den sekundären Defekte Trennung ist eine Herausforderung. Einige Studien im Zebrafisch und Maus-Mutanten haben keinen Zusammenhang zwischen Wimpern und Wnt-Signal 18-20 vorgeschlagen. Abweichungen in den Daten zurückgelegt werden Spezies, Gewebe oder zeitliche abhängige Unterschiede in Ciliar- Beiträge an Wnt-Signal. Darüber hinaus könnten normale Wnt Reaktionsfähigkeit beibehalten werden, wenn Basalkörpern funktionsfähig bleiben. Ein tiefer Einblick in die Rolle von Ciliar- Proteinen in zellulären Signalwegen und andere biologische Phänomene ist von entscheidender Bedeutung für das Verständnis der zellulären und Entwicklungsbiologie, sowie für die Entwicklung von zielgerichteten Behandlungsstrategien.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bei Cochlea-Gewebe für die Analyse vorzubereiten, gibt es ein paar wichtige Punkte zu beachten. Zum einen Hintergrund in der genetischen Unterschiede können die Cochlea-Phänotyp zu ändern, ist es notwendig zu analysieren und zu vergleichen, nur littermate Kontrollen machen. Zweitens vollständige Entfernung des Deckmembran ist erforderlich, um die besten Bilder mit Immunhistochemie zu erhalten, und ist wesentlich für SEM. Die Deckmembran ist eine undurchsichtige Struktur und kann die Zellen der Sinnesepithel direkt…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Der Autor möchte Matthew Kelley, Tiziana Cogliati, Jessica Gumerson, Uwe Wolfrum, Rivka Levron, Viola Kretschmer und Zoe Mann und für die kritische Bewertung des Manuskriptes. Diese Arbeit wurde durch den Sofja Kovalevskaja-Preis (Humbodlt Foundation) und der Johannes-Gutenberg-Universität, Mainz, Deutschland finanziert.
Materials
| Tools/Equipment | |||
| Silicone elastomere – Sylgard 184 | Sigma-Aldrich | 761028-5EA | See Note 2 |
| Micro dissecting scissors-straight blade | Various | ||
| Fine forceps (no. 5 and 55) and blunt forceps | Various | ||
| Dissecting microscope. | Various | ||
| Uncoated glass microscope slides | Various | ||
| Microscope cover slips (22 mm × 40 mm × 0.15 mm) | Various | ||
| Transfer pipettes | Various | ||
| Minutien pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| SEM sample holder | tousimis | 8762 | |
| Scanning electron microscopy studs | TED PELLA | 16111 | |
| PELCO Tabs: Carbon adhesive | TED PELLA | 16084-3 | |
| Fluorescent Microscope | Various | ||
| Critical Point Dryer | Various | ||
| Scanning Electron Microscope | Various | ||
| Glass microscope slides | Various | ||
| Glass coverslips | Various | ||
| Kimwipe Tissue | Various | ||
| Fine Paint Brush | |||
| Reagents | |||
| 1× Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco/Life Technologies | 10010023 | |
| Paraformaldehyde (PFA) (EM Grade Required for EM) | Various | Prepare a 4% solution in 1× PBS made fresh each time. EM Grade Required for EM. | |
| 2.5% Glutaraldehyde Grade1 | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Tris-HCl (pH 7.5) | Various | ||
| NaCl | Various | ||
| CaCl 2 | Various | ||
| Triton X-100 | Various | ||
| Normal Goat Serum | Various | ||
| AffiniPure Fab Fragment Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-007-003 | |
| Fluoromount-G Mounting media | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| 10× Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco/Life Technologies | 14065 | |
| Hepes | Gibco/Life Technologies | 15630-080 | |
| Osmium tetroxide (OsO4 ) | Sigma-Aldrich/Fluka Analytical | 75632 | |
| Tannic acid | Sigma-Aldrich | 403040 | |
| Ethanol 200 proof | Various | ||
| Antibodies | |||
| anti Arl13b | Protein Tech | 17711-1-AP | Suggested concentration 1:1000 |
| anti acetylated tubulin (611-B1) | Sigma-Aldrich | T6793 | Suggested concentration 1:800 |
| anti gamma tubulin (GTU-88) | Sigma-Aldrich | T6557 | Suggested concentration 1:200 |
| anti Zo_1 | Invitrogen | 40-2300 | Suggested concentration 1:500 |
| Myosin VI | Proteus Biosciences | 25-6791 | Suggested concentration 1:1000 |
| Myosin VIIa | Proteus Biosciences | 25-6790 | Suggested concentration 1:1000 |
| anti Vangl2 | Merk Millipore | ABN373 | Suggested concentration 1:250 |
| anti Gαi3 | Sigma-Aldrich | G4040 | Suggested concentration 1:250 |
| Alexa Fluor® 488 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12379 | Suggested concentration 1:300-1000 |
| Alexa Fluor® 568 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12380 | Suggested concentration 1:300-1000 |
Riferimenti
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