Summary

माउस कान और पूंछ के ऊतकों से उत्पन्न प्राथमिक तंतुकोशिका संस्कृति

Published: January 10, 2016
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Summary

हम कान और चूहों की पूंछ से प्राथमिक fibroblasts पैदा करने के लिए एक सरल और त्वरित प्रयोगात्मक प्रक्रिया का वर्णन है। प्रक्रिया विशेष पशु प्रशिक्षण की आवश्यकता नहीं है और अप करने के लिए 10 दिनों के लिए आरटी पर संग्रहीत कान से fibroblast संस्कृतियों की पीढ़ी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

Abstract

प्राथमिक कोशिकाओं ऊतकों से सीधे प्राप्त कर रहे हैं और स्थापित सेल लाइनों से विवो में कोशिकाओं की शारीरिक स्थिति के अधिक प्रतिनिधि होने के लिए लगा रहे हैं। हालांकि, प्राथमिक सेल संस्कृतियों आम तौर पर एक परिमित जीवन काल है और बार-बार फिर से स्थापित किए जाने की जरूरत है। Fibroblasts प्राथमिक कोशिकाओं के एक आसानी से सुलभ स्रोत हैं। यहाँ, हम कान और चूहों की पूंछ से प्राथमिक fibroblast संस्कृतियों की स्थापना के लिए एक सरल और त्वरित प्रयोगात्मक प्रक्रिया पर चर्चा की। प्रोटोकॉल के लिए 10 दिनों के लिए आरटी पर संग्रहीत कान से प्राथमिक fibroblast संस्कृतियों स्थापित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। प्रोटोकॉल का सावधानी से पालन किया जाता है, संदूषण कुछ मामलों में विस्तारित समय के लिए भंडारित गैर बाँझ ऊतक के उपयोग के बावजूद घटित होने की संभावना नहीं है। Fibroblasts संस्कृति में तेजी से पैदा और replicative वार्धक्य से गुजरने के पहले पर्याप्त संख्या का विस्तार किया जा सकता है।

Introduction

प्राथमिक कोशिकाओं में इन विट्रो की शर्तों के तहत ऊतक और सुसंस्कृत रहने से निकाली गई है। यह आम तौर पर प्राथमिक कोशिकाओं को और अधिक बारीकी से शारीरिक स्थिति और वे अमर या ट्यूमर सेल लाइनों 1 से शुरु हुआ, जिसमें से ऊतक के आनुवंशिक पृष्ठभूमि के समान माना जाता है कि। कारण है कि, प्राथमिक कोशिकाओं जैविक सवालों 2,3 के अध्ययन के लिए एक उपयोगी मॉडल प्रतिनिधित्व करते हैं। हालांकि, अनिश्चित काल के बढ़ने कि स्थापित सेल लाइनों के विपरीत, प्राथमिक कोशिकाओं अंततः संस्कृति में वार्धक्य से गुजरना है और अक्सर फिर से स्थापित किए जाने की जरूरत है।

आमतौर पर इस्तेमाल किया प्राथमिक कोशिकाओं फ़ाइब्रोब्लास्ट, उपकला कोशिकाओं, endothelial कोशिकाओं, टी कोशिकाओं, बी कोशिकाओं, अस्थि मज्जा व्युत्पन्न मैक्रोफेज (BMDM) और अस्थि मज्जा व्युत्पन्न वृक्ष के समान कोशिकाओं (BMDC) शामिल हैं। Fibroblasts अक्सर प्राथमिक सेल संस्कृति मॉडल के रूप में उपयोग किया जाता है। वे अन्य प्राथमिक कोशिकाओं से अधिक महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करते हैं। सेल संस्कृतियों आसानी से आसानी से बनाए रखा है, की स्थापना की और कोई purifica की आवश्यकता होती हैसंस्कृति के लिए पूर्व कोशिकाओं के tion। वे तेजी से प्रारंभिक प्रसार और विशेष मध्यम या सक्रियण प्रोटोकॉल के लिए कोई आवश्यकता है। Fibroblasts कुशलता से जैविक, रासायनिक और भौतिक प्रोटोकॉल 4,5 का उपयोग कर ट्रांसफ़ेक्ट किया जा सकता। सेल संस्कृतियों की स्थापना करने से पहले आरटी पर अप करने के लिए 10 दिनों के लिए कान की दुकान करने की संभावना है। Fibroblast संस्कृतियों साइटोप्लास्मिक प्रक्रियाओं के दृश्य के लिए अनुकूल और प्रेरित स्टेम (आईपीएस) कोशिकाओं 6 में reprogramming के लिए उपयुक्त हैं।

Fibroblasts कोलेजन प्रोटीन और बाह्य मैट्रिक्स 7 छिपाना कि संयोजी ऊतक के महत्वपूर्ण कोशिकाओं रहे हैं। वे कई ऊतकों 8 में संरचनात्मक ढांचा प्रदान करते हैं और घाव भरने और ऊतकों की मरम्मत 9,10 में एक आवश्यक भूमिका निभाते हैं।

यहाँ, हम fibroblast कान से संस्कृतियों और चूहों 11 की पूंछ की स्थापना के लिए एक सरल और त्वरित (<4 घंटा) प्रोटोकॉल का वर्णन है। प्रोटोकॉल न्यूनतम माउस की आवश्यकता हैअनुभव (अन्य प्रोटोकॉल 12,13 के विपरीत) ऊतकों फसल के लिए और अप करने के लिए 10 दिनों के लिए आरटी पर माध्यम में संग्रहित कान से संस्कृतियों की स्थापना के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

Protocol

चूहे euthanization तक संस्थागत दिशा निर्देशों (संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) के दिशा निर्देशों सिंगापुर के राष्ट्रीय विश्वविद्यालय में और प्रयोगशाला पशु अनुसंधान के लिए राष्ट्रीय सलाहकार समिति (NACLAR) के दि?…

Representative Results

ऊतक मलबे का एक महत्वपूर्ण राशि में ऊतक परिणामों से fibroblasts की निष्कर्षण (चित्रा 1)। ऊतक मलबे के विपरीत, fibroblasts दिन 1 और संस्कृति के बीच 3 टिशू कल्चर प्लास्टिक की सतहों का पालन करें। fibroblast संस्कृतियों का माध…

Discussion

यहाँ हम कान और चूहों की पूंछ से प्राथमिक fibroblast संस्कृतियों की स्थापना के लिए एक सरल, सस्ता और तेज प्रयोगात्मक प्रक्रिया प्रदान करते हैं। निकासी के ऊतक के 3 दिन बाद अलगाव के भीतर पक्षपाती और तेजी से विभाजि…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the NRF grant HUJ-CREATE – Cellular and Molecular Mechanisms of Inflammation.

Materials

RPMI-1640 HyClone SH30027.01
Fetal Calf Serum HyClone SV30160.03
2-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148
Asparagine Sigma-Aldrich A4159
Glutamine Sigma-Aldrich G8540
Penicillin/Streptomycin HyClone SV30010
Ethanol Merck Millipore 107017 Absolute for analysis
Collagenase D Roche Diagnostics 11088866001 From Clostridium histolyticum, lyophilized, non-sterile
Pronase protease Merck Millipore 53702 From Streptomyces griseus 
Tris buffer (pH 8) 1st BASE 1415 Ultra pure grade
0.5M EDTA (pH 8) 1st BASE BUF-1053 Biotechnology grade
10X Phosphate Buffered Saline (PBS) 1st BASE BUF-2040-10X4L Ultra pure grade
Trypsin-EDTA solution 10X Sigma-Aldrich 59418C-100ML 0.5% trypsin, 0.2% EDTA, trypsin gamma irradiated by SER-TAIN process, without phenol red, in saline
Amphotericin B Sigma-Aldrich A2492-20ml 250 μg/ml in deionized water, sterile-filtered
Scissors Aesculap
Forcep Aesculap AE-BD312R
0.2 μM syringe filter Sartorius Stedim 16534
70 μM cell strainer SPL 93070
Syringe plunger Terumo SS+10L
Cryovial tube NUNC 368362
1.7 ml microcentrifuge tube Axygen MCT-175-C
10 cm cell culture dish Greiner 664160 Cell culture treated dish 
15 ml conical bottom tube Greiner 188271
50 ml conical bottom tube Greiner 227261
Water bath GFL 1002
Centrifuge Eppendorf 5810R
Incubation shaker Sartorius Stedim Certomat-BS1
Zeiss Axiovert 25 light microscope Carl Zeiss AG

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Khan, M., Gasser, S. Generating Primary Fibroblast Cultures from Mouse Ear and Tail Tissues. J. Vis. Exp. (107), e53565, doi:10.3791/53565 (2016).

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